پس از انجام واکنش، برای تأئید حضور محصول با طول مورد نظر از الکتروفورز افقی با ژل آگارز ۱/۰% استفاده شد. در صورت تأیید از ژل آگارز ۸/۰% (ژل ضخیم) برای استخراج از ژل استفاده گردید.

۳-۵-۱-۵-استخراج از ژل
پس از تایید محصول خالص سازی به وسیله الکتروفورز برای حذف باندهای غیر اختصاصی، خالص‌سازی ژن از ژل‌آگارز ۸/۰%، ضخیم انجام گرفت.
پس از تهیه ژل‌آگارز ضخیم و توزیع هر نمونه در دو چاهک و انجام الکتروفورز، ژل به مدت ۱۰ دقیقه با محلول اتیدیوم برماید رنگ شده و با آب شستشو داده شد و باندهای ایجاد شده با بهره گرفتن از دستگاه ترانس لومیناتور در طول موج nm 280 مشاهده شدند. سپس باند مورد نظر یعنی باند ۱۵۰۰ نوکلئوتیدی در نهایت دقت با لانست تمیز بریده شد. جداسازی وخالص‌سازی با بهره گرفتن از کیت استخراج از ژل شرکت Genall ساخت کره، طبق مراحل زیرانجام شد.

1. 1. وزن کردن ژل بریده شده

1. 1. اضافه کردن ۳ حجم از بافر BD با توجه به وزن ژل بریده شده

1. 1. انکوباسیون در دمای ºC50 به مدت ۱۰ دقیقه (هر۲ تا ۳ دقیقه یکبار ورتکس انجام شود)

1. 1. قرار دادن ستون روی تیوب ml 2، انتقال تمام محلول بدست آمده از هضم ژل به روی آن و سانتریفوژ برای ۱ دقیقه در rpm13000

1. 1. دورریختن محلول زیری و افزودن مجدد ml5/0 از بافر wash buffer و سانتریفوژ برای ۱ دقیقه در rpm13000 و دور‌ریختن محلول زیری

1. 1. تکرار مرحله قبل

1. 1. سانتریفوژ کردن مجدد تیوپ و ستون برای ۱ دقیقه در rpm13000 و دور ریختن محلول زیر ستون.

1. 1. قرار دادن ستون برروی یک تیوبml 1.5 تمیز

۱۰- ریختن µl 50 از EB (Elution Buffer) و یا dH2O روی مرکز فیلتر به منظور جدا کردن نمونه از ستون و سانتریفوژ برای ۱ دقیقه در rpm13000
۱۱- افزودن مجدد µl 30 از EB و تکرار مرحله قبل
محصول به دست آمده برای ۵۵ با هم مخلوط گشته و به حجم ۲۵ جدول آمده است که مقادیر آن با هم مخلوط گشته و به حجم ۲۵دید.محصولم انجام مراحل بعدی مانند تعیین توالی و کلون کردن نگهداری گردید. مقدار ۳۰ میکرولیتر از مایع زیر ستون برای تعیین توالی به شرکت ماکروژن کره ارسال گردید.
۳-۵-۱-۶-کلون کردن محصولات PCR
از آن جایی که در توالی یابی ژن با بهره گرفتن از محصول PCR، معمولاً حدود هفتاد نوکلئوتید ابتدایی و انتهایی توالی به درستی خوانده نمی شود، محصولات PCR ابتدا در پلاسمید TA vectorکلون شده و سپس توالی یابی شدند. به منظور کلون کردن محصول به دست آمده از مرحله قبل مراحل زیر به ترتیب انجام شد.
۳-۵-۱-۷-ساخت سلول مستعد
برای ساخت سلول مستعد یک کلونی از باکتری E. coli XL1- Blue در ml50 از محیط LB به مدت ۱۶ ساعت در انکوباتور ºC 37 رشد داده شد. پس از ۱۶ ساعت، ml 1 از محیط حاوی باکتری بهml 100 محیط LB در یک ارلن ۱ لیتری منتقل و تا رسیدن به OD 375/0 در ºC 37 گرماگذاری شد (حدود ۲ ساعت). سپس محیط کشت همراه باکتری، در دو فالکون ml 50 تقسیم شد. از این مرحله به بعد سلول‌ها روی یخ نگهداری می شوند. سلول‌ها به مدت ۷ دقیقه در rpm 5000 و دمای ºC 4 سانتریفوژ شده و پس از جمع آوری در ml 10 از محلول سرد mM CaCl₂60 سوسپانسیون شدند و به مدت ۵ دقیقه در rpm5000 و دمای ºC 4 سانتریفوژ شدند. پس از دور‌ریختن محلول رویی، سلول‌ها دوباره در ml 10 از محلول سرد CaCl₂ سوسپانسیون شده و ۳۰ دقیقه در یخ انکوبه شدند. در نهایت سلول‌ها در ml 5/0 از محلول سرد CaCl₂ و گلیسرول ۱۵% (lμ ۵۰۰) سوسپانسیون شده و در ویال‌های ml 0.2 به میزان lμ ۵۰ تقسیم شدند و سریعا به فریزر ºC85- منتقل شدند. در مرحله بعد، TA vector با آنزیم محدودالاثرSmaI برش داده شد (Sambrook, 2001).
۳-۵-۱-۸-اتصال محصول PCR به حامل
به منظور وارد کردن بخش میانی ژن باکتری در پلاسمید هضم شده TA با غلظت ng/ml100، از آنزیم T₄ DNA Ligase طبق جدول ۳-۸ استفاده شد.
جدول ۳-۸) مقادیر و ترکیبات به کار رفته در واکنش اتصال بخش میانی ژن به پلاسمید TAهضم شده (مقیمی, ۱۳۹۱)