پلیسوربات ۸۰

۱

تریآمونیوم سولفات

۲

استات سدیم

۵

سولفات منیزیم

۲/۰

سولفات منگنز

۰۵/۰

– برای تهیهی یک لیتر از محیط کشت مایع، ۲/۵۲ گرم از محیط کشت به یک لیتر آب اضافه شد.
– به منظور تهیهی محیط کشت MRS جامد با ۵/۱ درصد آگار، ۱۵ گرم آگار – آگار به یک لیتر محیط کشت مایع اضافه شد.
-pH نهایی محیط کشت MRS مایع معادل ۲/۰±۶ است.
– محیط مانیتول آگار پایه
به منظور تهیه محیط کشت اختصاصی برای شمارش سلولهای لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، اجزای تشکیل دهنده محیط کشت MRS (جدول ۲-۱) در یک لیتر از محیط کشت مایع، با یکدیگر مخلوط شده و به جای ۲۰ گرم در لیتر قند دکستروز، ۲۰ گرم در لیتر قند مانیتول در تهیه محیط کشت به کار رفت (سوکسی و همکاران). سپس با بهره گرفتن از اسید استیک گلایسیال (مرک آلمان) pH محیط کشت در ۲/۰±۶ تنظیم شد.
ب- مواد مورد استفاده جهت ریزپوشانی و پوششدهی باکتری پروبیوتیک و فرایند رهاسازی
– برای ریزپوشانی از صمغ فارسی[۵۳]، روغن کانولا (لادن، شرکت بهشهر، ایران) و امولسیفایرها شامل DATEM و PGPR90 استفاده شد.
– در آزمونهای رهایش از بافر فسفات استفاده شد و برای تهیهی آن از سدیم دیهیدروژن فسفات دو آبه و دیسدیم هیدروژن فسفات (مرک، آلمان) استفاده گردید.
ج- مواد مورد استفاده در تولید ماست پروبیوتیک
به منظور تهیهی ماست و برای حفظ یکنواختی نمونه های ماست طی انجام آزمایشها، از شیر خشک بدون چربی[۵۴] ساخت شرکت زرین سپاهان استفاده شد.
د- مواد مورد استفاده در ارزیابی مقاومت باکتری پروبیوتیک در برابر محیط شبیهسازی شده گوارشی
در آزمایشات مربوط به ارزیابی مقاومت باکتری نسبت به محیط شبیهسازی شده گوارشی از هیدروکسید سدیم (NaOH) و اسید هیدروکلریدریک (HCl) تولید شده توسط شرکت مرک آلمان، بایل بووین[۵۵] تولید شده توسط شرکت سیگما آلدریچ[۵۶] آلمان استفاده شد.

۳-۱-۳- میکروارگانیسم مورد استفاده
میکروارگانیسمهای مورد استفاده شامل باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 تهیه شده از آزمایشگاه میکروبیولوژی گروه علوم وصنایع غذایی دانشکده کشاورزی دانشگاه صنعتی و کشت‌های آغازگر در تولید ماست شامل لاکتوباسیلوسدلبروکی زیرگونه بولگاریکوس[۵۷] و استرپتوکوکوس ترموفیلوس[۵۸] تهیه شده از کریستین هانس دانمارک بودند.
۳-۲- عملیات و آزمونهای میکروبی
۳-۲-۱- فعال سازی و نگهداری باکتری پروبیوتیک
کشت خالص فریز شدهی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، در محیط کشت حاوی ۱۵ درصد گلیسرول که در فریزر oC80- نگهداری میشد، از نمونه های استوک[۵۹] موجود در کلکسیون میکروبی آزمایشگاه میکروبیولوژی ـ بیوتکنولوژی گروه علوم و صنایع غذایی دانشگاه صنعتی اصفهان تهیه شد. برای فعال سازی باکتری، میکروتیوب محتوی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، بعد از خارج کردن از فریز، در شرایط کاملا استریل و در کنار شعله، در دمای محیط قرارداده شد تا ذوب شود، سپس میکروتیوب به لولهای حاوی ۱۰ میلیلیتر از محیط کشتMRS استریل انتقال داده شد و در انکوباتور میکروآئروفیل (با ۵ درصد دی اکسیدکربن، دمای ۳۷ درجه و به مدت ۱۸ ساعت) گرمخانهگذاری شد. از این کشت روی سطح لام، گسترهی[۶۰] میکروبی تهیه شد و به منظور بررسی خصوصیات مورفولوژی باکتری، بوسیلهی میکروسکوپ نوری بررسی شد. پس از بررسیهای اولیه، سلولهای باکتری سه مرتبه و به صورت مداوم روی محیط MRS مایع و جامد کشت داده شدند. کشت ثانویه روی محیط کشت MRS جامد انجام شد و پلیتها در شرایط بیهوازی گرمخانهگذاری شدند. به منظور نگهداری کوتاه مدت، کلونیهای خالص تهیه شده بر روی محیط کشت MRS مورب[۶۱] کشت داده شد و بعد از گرمخانهگذاری به یخچال با دمای ۴ درجه انتقال شد و ماهانه کشت مجدد انجام شد. به منظور نگهداری طولانی مدت، ۵۰۰ میکرولیتر از کشت مایع فعال به میکروتیوب حاوی ۵۰۰ میکرولیتر گلیسرول ۱۵درصد حجمی/ حجمی استریل خالص اضافه شد و بلافاصله در ازت مایع منجمد شد. این نمونه ها در فریزر ۸۰- نگهداری شدند. برای تهیهی کشت فعال در هر مرحله، کلونیهای خالص نگهداری شده در یخچال را در محیط MRS مایع تلقیح کرده و باکتریها به مدت ۱۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه گرمخانه‌گذاری شدند.
۳-۲-۲- آزمونهای بیوشیمیایی به منظور شناسایی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7
۱- رنگ آمیزی گرم
به منظور رنگآمیزی گرم از کلونی تازه، گسترهی میکروبی تازه تهیه شد. پس از خشکشدن نمونه در مجاورت هوا، تثبیت حرارتی صورت گرفته و سپس رنگ کریستال بنفش[۶۲] به گستره اضافه شد. بعد از یک دقیقه به صورت ملایم با آب شسته شد تا رنگ اضافی پاک شود. در مرحلهی بعد از محلول لوگول استفاده شد. مشابه با مرحلهی قبل، بعد از یک دقیقه گسترهی میکروبی با جریان ملایم آب شست و شو داده شد و به منظور رنگ بری نیز، در مرحله بعد، الکل مطلق به گستره اضافه شد و بعد از ۳۰ ثانیه سطح لام شسته شد. در نهایت سافرانین به مدت یک دقیقه به گستره اضافه شد و بعد از شستن لام و خشک کردن آن در مجاورت هوا شکل، آرایش سلولی و تعیین گرم با بهره گرفتن از میکروسکوپ نوری مشخص شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).

۲- آزمون کاتالاز
برای انجام این آزمایش ابتدا یک قطره آب اکسیژنهی ۳ درصد (V/V) روی لام شیشهای قرار داده شد و توسط یک آنس استریل بخشی از یک کلونی تازه به آن اضافه شد و کاملا مخلوط شد. تشکیل یا عدم تشکیل حباب دو مرتبه بررسی شد؛ یکبار بلافاصله بعد از اضافه کردن کلونی و یکبار ۵ دقیقه بعد از اضافه کردن کلونی بررسی شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).
۳- آزمون اسپورزا بودن
برای تعیین اسپورزا بودن باکتری از روش شفر- فولتون[۶۳] استفاده شد. به این صورت که ابتدا گسترهی میکروبی تهیه شد و پس از تثبیت حرارتی رنگ آمیزی با مالاشیت سبز به مدت ۵ دقیقه انجام شد و بعد از شست و شو با جریان ملایم آب سفرانین به مدت یک دقیقه اضافه شد. سپس سطح اسلاید شسته و خشک گردید و در نهایت گسترهی میکروبی با میکروسکوپ نوری، به منظور حضور یا عدم حضور اسپور بررسی شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).
۳-۳- آنالیز شیمیایی شیر خشک بدون چربی و صمغ فارسی
کلیه آزمونهای شیمیایی در سه تکرار انجام شدند.
۳-۳-۱- اندازه‌گیری خاکستر
برای اندازه گیری خاکستر، کروزهها را به وزن ثابت رسانده شد. به این منظور کروزهها به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۶۰۰ درجه سانتیگراد قرار داده شدند. سپس یک تا ۲ گرم از نمونه های مورد بررسی، درون کروزه وزن شدند و تا پایان متصاعد شدن دود روی اجاق الکتریکی قرار داده شد. سپس کروزه‌ها در دمای ۵۵۰ تا ۶۰۰ درجه به مدت ۵ ساعت قرار داده شدند. در انتهای این زمان نباید دیگر ذرات سیاه رنگ در کروزه مشاهده شود. سپس کروزهها را در دسیکاتور قرار داده شدند و نمونه ها وزن شدند. درصد خاکستر از فرمول زیر محاسبه شد (سوزان- نیلسون، ۲۰۱۰):
= درصد خاکستر
۳-۳-۲- اندازه گیری رطوبت و ماده خشک
ابتدا ظروف آلومینیومی به همراه درب آنها در آون با دمای ۱۰۵ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ دقیقه قرار گذاشته شد. سپس آنها را به دسیکاتور انتقال داده تا سرد شده و به دمای ثابت برسند. ۱ تا ۲ گرم نمونه در ظروف توزین شد و تا زمان رسیدن به وزن ثابت در آون با دمای ۱۰۵ درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. بعد از خارجکردن از آون و سرد کردن ظروف حاوی نمونه مجددا آنها را توزین کرده و درصد رطوبت یا ماده خشک با بهره گرفتن از فرمولهای زیر محاسبه شدند (واسیلجویک، ۲۰۰۷).

درصد رطوبت-۱۰۰= درصد ماده خشک
۳-۳-۳- اندازه گیری چربی
۳-۳-۳-۱- روش سوکسله
اندازه گیری چربی، برای صمغ فارسی و شیر خشک با روش سوکسله انجام شد و درصد چربی با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد:
= درصد چربی

۳-۳-۳-۲- روش ژربر
اندازه گیری چربی برای نمونه های ماست به روش ژربر انجام شد.

۳-۳-۴- اندازه گیری پروتئین و ازت کل
اندازه گیری پروتئین و ازت کل در سه مرحله هضم، تقطیر و تیتراسیون انجام شد.
الف- هضم
در این مرحله ۵/۱ گرم نمونه استفاده شد، ولی برای نمونه هایی که مقدار پروتئین بالا دارند ۵/۰ گرم از نمونه کافی میباشد. ۵/۰ گرم از نمونه شیر خشک و ۵/۱ گرم نمونه های ماست و صمغ فارسی را در فلاسک هضم مخصوص کلدال ریخته و ۱/۱۱ گرم کاتالیزور(مخلوط سولفات پتاسیم، سولفات مس و سلنیم به ترتیب با نسبت ۱:۱۰:۱۰۰) همراه با ۲۵ میلیلیتر اسیدسولفوریک غلیظ به آن اضافه شد. ابتدا به فلاسکهای روی دستگاه هضم مخصوص، حرارت ملایم داده شد تا کف کردن محلولها متوقف شود. سپس حرارت را بالا برده تا محلولها بجوشند. این عمل تا زمان روشن شدن رنگ محلولها ادامه یافت. لازم به ذکر است نمونه های ماست بعد از اینکه در فلاسک هضم ریخته شدند، به مدت ۱ساعت درون آون و در دمای ملایم خشک شدند.
ب- تقطیر
بعد از مرحلهی هضم و تشکیل محلول زلال، نمونه ها را در دستگاه تقطیر قرار داده و ۴۰ میلیلیتر آب مقطر و ۱۲۰ میلیلیتر سود ۵۰ درصد به آنها اضافه شد و با برقراری جریان در داخل دستگاه، آمونیاک آزاد شد و در ارلن مایر حاوی ۵۰ میلیلیتر اسید بوریک ۲ درصد و چند قطره معرف فنول رد حل و جمعآوری شد. حل شدن تدریجی آمونیاک باعث تغییر رنگ نمونه های درون ارلن مایر به زرد شد. مرحلهی تقطیر تا زمان رسیدن محلولها به حجم ۲۰۰ میلی لیتر ادامه یافت.
ج- تیتراسیون
بعد از خارج کردن نمونه ها از زیر دستگاه تقطیر، آمونیاک موجود در آنها با اسید کلریدریک ۱/۰ نرمال تیتر شد و درصد پروتئین با فرمول زیر محاسبه شد (سوزان – نیلسون، ۲۰۱۰).

۳۸/۶× درصد ازت = درصد پروتئین
۳-۳-۵- اندازه گیری اسیدیته بر حسب اسید لاکتیک
۱ تا ۲ گرم نمونه را در ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر با دمای ۸۰ درجه سانتیگراد حل کرده سپس در برابر معرف فنلفتالئین ۲ درصد، تا ایجاد رنگ صورتی پایدار با سود ۱/۰نرمال استاندارد شده، تیترشد. مطابق رابطه زیر اسیدیته بر حسب اسیدلاکتیک تعیین گردید (سوزان- نیلسون، ۲۰۱۰):