جهش در ژن هایی که عوامل رشد راکد می کنند، می تواند سبب سرطان زایی آن ها شود.چنین وضعیتی در پروتو انکوژن کد کننده زنجیره بتای عامل رشد مشتق از پلاکت ها[۱۰] دیده می شود(۳).
۱ـ۵ـ۱ـ۱ـ ۳ گیرنده های عوامل رشد
گیرنده های عوامل رشد، پیام های خارج سلولی ( عوامل رشد) را به مسیرهای انتقال پیام داخل سلول
می رسانند.مهمترین این ها در تغییر شکل بدخیمی، گیرنده های تیروزین کینازی دارای یک بخش خارج سلولی، ناحیه اتصالی لیگاند، یک ناحیه داخل غشایی[۱۱] و یک یا دو پروتئین کیناز بین سلولی می باشند.اتصال فاکتور رشد (لیگاند) به ناحیه خارج سلولی گیرنده، پیام دیمریزه شدن گیرنده ها را می دهدکه نتیجه آن، افزایش فعالیت کینازی گیرنده ها می باشد.این عمل باعث فسفریلاسیون خود به خودی واحدهای تیروزین گیرنده می شودکه منجر به انتقال پیام به درون هسته می گردد(۳).
شکل۱ـ ۵: فعال شدن گیرنده ی تیروزین کینازی داخل غشایی که منجر به ۴ مسیر پیام رسان پایین دستی می شود(۳)
انکوژن های متعددی یافت شده اند که گیرنده های عامل رشد راکد می کنند. اشکال انکوژنیک این گیرنده ها بدون اتصال به عوامل رشد به فرم دیمر و فعال هستند.بنابراین گیرنده های جهش یافته، پیام های میتوژنیک مداومی را به سلول می رسانند.
گیرنده های عامل رشد در تومورهای انسانی به طرق مختلفی فعال می شوند که شامل جهش ها، بازآرایی ژن ها[۱۲]، و بروز بیش از حد پروتوانکوژنRET ( یک گیرنده کینازی) می باشند(۳).
۱ـ ۵ـ ۱ـ۱ـ ۴ خانواده انکوژنی RAS
بهترین و شناخته شده ترین نمونه انکوپروتئین های انتقال دهنده پیام، خانواده RAS از پروتئین های متصل شونده به گوانوزین تری فسفات (GTP) می باشدکه مطالعات زیادی بر روی این القاء کننده پیام صورت گرفته است. پروتئین های RAS ابتدا به شکل انکوژن های ویروس کشف شدند.در فعال شدن انکوژنRAS˛ جهش های نقطه ای نقش به سزایی دارند.حدود ۱۰ تا ۲۰ درصد تمام تومورهای انسانی جهش در ژن RAS را دارا می باشند.حدود ۹۰ درصد آدنوکارسینوم های پانکراس و کلانژیوکارنسیوم ها حاوی یک جهش نقطه ای در ژن RAS هستند، این موضوع در مورد ۵۰ درصد سرطان های کولون، اندومتر و تیروئید و ۳۰ درصد آدنوکارسینوم های ریه ولوسمی های میلوئید نیز صدق می کند.جهش های ژن RAS در بعضی سرطان ها نامعمول می باشد و یا حتی وجود ندارد( به خصوص سرطان گردن رحم و یا PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)) اکثر جهش های این ژن، کدون ۱۲ را در گیر می کنند.
در مجموع کارسینوم ها دچار جهش K-RAS می شوند، در حالیکه تومورهای با منشأ خونی متحمل جهش های ژن N-RAS می شوند(۳).
۱ـ ۵ـ ۱ـ۱ـ ۵GTPase های همراه غشاء : مسیرRAS
یکی از سازوکارهایی که پیام ها را در غشاء سلول فراوری و منتشرمی کند اتصال و هیدرولیزGTP است.آنزیم های همراه غشایی که به نام GTPaseشناخته می وشند، زمانی که GTP به صورت غیر کووالان به آن ها متصل می شود فعال می گردندوقتی که GTP به GDP هیدرولیز شود، غیر فعال می گردند.نقش GTPase ها درپیام رسانی سلول های سرطانی با کشف خانواده ی انکوژن های RAS مشخص گردید.پروتئین هایی که توسط RAS رمز می شوندGTPase های غشایی هستندکه وقتی به شکل جهش یافته موجود باشند نقش مهمی در خواص ناهنجار رشدی سلول های سرطانی ایفا می کنند(۱).
شکل ۱ـ ۶ : تنظیم اتصال به و هیدرولیز GTPبه واسطه ی RAS :پروتئن های RAS به طور ذاتی فعالیت اتصال به GTP کمی دارندکه از طریق همراهی فیزیکی با عامل تعویض نوکلئوتید گوانین (GEF) به شدت تحریک می شود.به طور مشابه هیدرولیز GTPبا RAS توسط پروتئن های فعال کننده ی GTP ASE (GAP) تحریک می شود.بنابر این الگوی دودویی پیام رسانی RAS (خاموش-روشن) به شدت تنظیم شده است(۱).
سه ژن RAS انسانی (H-RAS , N-RAS,K-RAS) پروتئین های P21 کیلودالتونی با قرابت بسیار نزدیکی را رمز می کنند که در سطح داخل غشاء سلولی مستقر[۱۳] می شوند.این پروتئین ها اساساًبه عنوان کلیدهای مولکولی عمل می کنندکه با اتصال و سپس هیدرولیز GTP به ترتیب روشن و خاموش می شوند.این اسلوب دودویی پیام رسانی، توسط پروتئین های دیگری که چرخه ی GDP/GTP را تنظیم می کنند، به شدت کنترل
می گردد.پروتئین های RAS بین حالت متصل به GTP ( فعال) و جدا ( غیرفعال) در تعادل هستند.پروتئین های RAS به طور ذاتی به لحاظ فعالیت اتصال به GTP و هیدرولیز آن سطح پایینی دارند.چرخه ی GDP/GTP توسط RASبه کمک دو نوع از پروتئین های تنظیمی کنترل می شود.عوامل تعویض نوکلئوگوانین[۱۴] (GEF) تشیکل حالت فعال متصل به GTP را تحریک می کند.دو مثال از GEF ها، پروتئین های SOS1 وsos2 هستند که براساس ژن دروزوفیلایی Sons of sevenless نام گذاری شده اند و همولوژی قابل ملاحظه ای با یکدیگر دارند.پروتئین های SOSبه طور مستقیم با RAS برهم کنش می دهند
و سبب تحریک جایگزینی GTP به جای GDP می شوند ـ بر هم کنش RAS با پروتئین های فعال کننده GTP ase (GAPS)[15] هیدرولیز GTP را تسهیل می کنند.GAP ها، پروتئین های فعال کننده ی GTP ase بنام های p120 GAP ونوروفیبرومین[۱۶] را که توسط ژن مهار کننده ی تومور NF1 رمز می گردند، شامل می شوند.
GEFها وGAP ها با تحت تأثیر قرار دادن تعادل بین شکل متصل به GTP، پیام رسانی RAS را تحت تأثیر قرار می دهند. برای این که RAS فعال باشد نیاز دارد که با غشاء همراه باشد.در این حمل RAS در پاسخ به پیام های بی شمار بالا دستی نظیر آن ها که از RTK های مجاور ناشی می شوند فعال می گردد.
شناخته شده ترین ارتباط RTK-RAS، ارتباطی است که با گیرنده ی فاکتور رشد اپیدرمی[۱۷] (EGFR) برقرار می کند.این فاکتور رشد پس از این که به واسطه ی حضور لیگاند فعال شده دمین سیتوپلاسمی خود را در یک بنیان تیروزین خاصی فسفریله می کند.یک پروتئین مبدل[۱۸] به نام GRB2 از طریق دامین SH2 به کمپلکس EGFR فعال می پیوندد.پروتئین GRB2 یک پروتئین SOS را به خدمت می گیرد و آن را به نزدیکی RAS می آورد.پروتئین SOS، RAS را تحریک می کند که GTP را جایگزین GDP نماید.در نتیجه تغییرات ساختاری را در آن ایجاد می کند.بدین طریق RAS فعال می شودومی تواند با ملکول های پایین دستی بر هم کنش دهد.پروتئین های GAP که در غیر فعال کردن RAS نقش دارندنیز دامین SH2 دارند که به آن ها این امکان را می دهد که توسط غشاء به کار گرفته شوند.
شکل ۱ـ۷:پروتئین های RAS توسط RTK ها فعال می شوند. RTKهای ترا غشایی نظیر EGFR با اتصال به لیگاند فعال می شوندوپروتئین های GRB2 و SOS را با کار می گیرند. SOSیک GEFاست که باعث جایگزینی GTP به جای GDP می گرددودر نتیجه در ساختمان RAS تغییرایجاد می کند.این شکل RAS می تواند با مولکول های پائین دستی نظیر سرین/ترئونین کینازRAF بر هم کنش دهد.پروتئین های GAP که هیدرولیزGTPرا تحریک می کنند می توانند توسط غشا به کار گرفته شوند و پاسخ های پائین دستی را کاهش دهند(۱).
تغییرات در ساختمان RASکه دراثر اتصال آن به GTP اتفاق می افتد، RAS را قادر می سازد که مولکول های پیام رسان پایین دستی را فعال نماید.به نظر می رسدکه مهمترین آن ها، خانواده ی سرین ترئونین کینازهای RAF هستند.طی یک فرایند چند مرحله ای، سه RAF کیناز به واسطه ی فعال شدن توسطRAS به سمت غشاء کشیده شده فعال می گردند.پس از این که پروتئین های RAF فعال شدند، دو پروتئین دیگر را که از خانواده ی پروتئین های MEK هستندوبا نام دیگر MAP کیناز کیناز (MAPKK) نیز شناخته می شوند، فسفریله و فعال می کنند، MEK ها پروتئین کینازهای غیر معمولی هستندکه اختصاصیت دوگانه دارند یعنی می توانند پروتئین ها را هم بر روی بنیان های سرین و ترئونین و هم بر روی بنیان تیروزین فسفریله کننده در بین این مولکول ها، دوکینازی که توسط پیام های خارج سلولی تنظیم می شوند (ERKS) وجود دارند که به نام پروتئین کینازهای فعال شونده با میتوژن (Kinase ـ MAP)[19] هم نامیده می شوند. ERK های فعال شده این قابلیت را دارند که از غشاء هسته عبور کنند.بنابراین پروتئین های RAF از طریق فعال کردن پیاپی MEK ها و ERK ها ابشاری از پیام رسانی پروتئین کینازی را به راه می اندازند که سیتوپلاسم را طی می کندودر هسته به ملکول های، مجری [۲۰]دسترسی پیدا می کنند( شکل ۱-۸)(۱و۷۶).
شکل ۱-۸ :پیام رسانی RAS،RTKرا به آبشارهای کینازی که بیان ژن و ترجمه ی پروتئین را تنظیم می کند متصل می سازد.RAS ها گرهی را می سازند که در آن گره مسیر های بالا دستی وپان دستی به هم میرسند.پروتئین های RAS در پاسخ به پیام رسانی RTK، اعضای خانواده ی RAFرا فعال می کنند.RASمی تواند توسط پروتئین های GAPنظیر محصول ژن NF1 غیر فعال گردد.پروتئین هایRAF ،MEK ها را فسفریله کرده فعال می کنندوآنها نیز به نوبه ی خود ERK ها را فعال می نمایند.پروتئین های ERK می توانند پروتئین های همراه ریبوزمی را فعال کنند و در نتیجه ساخته شدن پروتئین ها را تحت تاثیر قرار دهند.به علاوهERK ها می توانند به هسته رفته فاکتورهای رونویسی مختلفی را تنظیم نمایند.بنابر این پیام RAS در سرتاسر سلول منتشر می شود(۱).
ERK ها مجریان اولیه ی بسیاری از پیام های تکثیری هستند. ERK ها از طریق فسفریلاسیون می توانند به طور مستقیم عوامل رونویسی را فعال کنندوبنابراین بیان ژن ها را تحت تأثیر قرار دهند.سوبستراهای مهم دیگر ERK عبارتند از پروتئین کینازهای S6 ریبوزمی (RSKs)، که تنظیم کننده ی سننزپروتئین هستند و GTP ase های شبیه Rho که مشخص شده است در شکل و تحرک سلول تغییراتی ایجاد می کنند.
مسیر RAS بر بسیاری از جنبه های رشد سلول که درسلول های سرطانی دچار ناهنجاری می شوند، تأثیر
می گذارد(۱).
شکل۱-۹ :مسیرRAS-RAF-MAP kinase(102)
در هدایت سیگنال میتوژنیس از اتصال فاکتورهای رشد وفعال شدن RASوRAFسبب فعال سازی MEKوMAPکیناز می شود.این موجب فسفریلاسیون فاکتور های رونویسی (مثل ELK1وJUN) به وسیله ی MAPکیناز یاآنزیم های مربوط به آن می شودواین منجر به بیان ژن های حدواسط زود (برای مثال c fos و c jun) وهدایت فاکتور های رونویسی برای ژن های هدف می شود(۱).
۱-۵-۱-۱- ۶ ویژگی های ژن BRAF به عنوان یک انکوژن
ژن BRAFهمچنین به نام های BRAF1 و RAFB1نیز نامیده شده است.این ژن بر روی بازوی بلند کروموزم شماره ۷ وجود دارد(۷q34) . بین ژن های NDUFB2 و MRPS33 قرار دارد.
این ژن شامل ۱۸ اگزون است و شامل ناحیه ای به طول ۲۸۴/ ۱۹۰جفت باز است. mRNA رونویسی شده از این ژن ۲۴۷۸ جفت باز دارد(۳۲).
شکل۱-۱۰ ژن BRAF:اگزون ها به وسیله جعبه هایی پر رنگ آبی نشان داده شده اند.شماره اگزون در بالای آن و تعداد جفت بازها در پایین آن نشان داده شده است.اینترون ها به صورت میله هایی مشکی و تعداد جفت بازها نیز نشان داده شده است ATG و کدون پایان نیز به ترتیب نشان داده شده اند(۳۲)
۱-۵-۱-۱- ۶-۱ پروتئین BRAF
محصول این ژن پروتئینی است شامل ۷۶۶AA که وزن ملکولی آن ۴۳۶ و ۸۴ دالتون است.ژن BRAF پروتوانکوژنی است که به خانواده ی سرین، ترئونین کیناز تعلق دارد.همچنین عضوی از خانواده RAF همراه با ARAF و RAF1 است.ژن BRAFدر بسیاری از بافت ها بیان می شودو به ویژه در بافت های عصبی بیان بسیاربالایی دارد.محصول یا پروتئین حاصل از ژن BRAFیک پروتئین سیتوپلاسمی است(۳۲).
شکل ۱-۱۱ (پروتئین BRAF ):شماره های نشان داده شده درون جعبه شماره اگزون است که به یک قسمت از پروتئین ترجمه میشوند. سه جعبه ی درون این اگزون ها نشان دهنده ی ۳ ناحیه ی حفاظت شده ی پروتئین است که شامل CR3 و CR2 و CR1 است. رنگ سبز نشان دهنده ی ۳ دمین مختلف است. RBD ( دمین متصل شونده به RAS) CRD ( دمین غنی از سیتئین) و KD ( دمین کینازی) . یک موتیف گلیسینی محافظت شده (G LOOP) در اگزون شماره ۱۱ با رنگ قرمز نشان داده شده است و قطعه ی فعال کننده (AS) در اگزون شماره ۱۵ با رنگ بنفش نشان داده شده است. فلش های مشکلی مکان های مهم فسفریلاسیون پروتئین است. C:انتهای کربوکسیل پروتئین N:انتهای آمین پروتئین(۳۲).
۱-۵-۱-۱- ۶-۲ عملکرد BRAF
RAF یک سرین ترئونین کینازاست که به مسیر MAPK / ERK/MEK/ / RAF/RAS تعلق داردکه در هدایت سیگنال های میتوژنیک از غشاء سلول به هسته موثر است. RAS وقتی به GDP متصل است غیرفعال است ولی اگربه GTP متصل شودفعال می شودو شروع به فسفریلاسیون و فعال کردن ژن BRAF و فعال کردن سایر مسیرهای ابشاری می کند. چندین ژن در این مسیر فعال می شوند که از جمله آن ها می توان به سیلکین D1، سیلکینD2 و سیلکین D3و VEGF ( موثر در رگ زایی)، C-myc( عدم حساس بودن به سیگنال های ضد رشد) اینتگرین b3 ( تهاجم بافتی و جهش) و mdm2 ( حمله ی آپاپتوزی) اشاره کرد(۳۲).
۱-۵-۱-۱- ۶-۳ همولوژی BRAF
در BRAF سه ناحیه حفاظت شده وجود دارد(CR2 , CR3 وCR1) همراه با بقیه ی ژن هایRAF مثل ARAF وRAF1 . CR1 که شامل ۱۳۱ اسید آمینه است و دمین غنی از سیتسین ( CRD) است که بیشتر محل اتصال به RAS ( RBD) نام دارد. این دو دمین به GTP ـ RAS متصل می شوند، CR2 که دارای ۱۶ اسید آمینه است و غنی از سرین و ترئونین است و شامل S365به عنوان یک بازدارنده از فسفریلاسیون است و در نهایت CR3 که ۲۹۳ اسید آمینه دارد و دارای دمین کینازی است و همچنین موتیفGXGXXG GLOOPاست( که در بسیاری از کینازهای انسانی بسیار حفاظت شده است) و همچنین شامل قطعه فعال کننده و مکان های فسفریلاسیون تنظیمی S446 وS447 و D448 وD449 وT599 وS602 است(۳۲).
۱-۵-۱-۱- ۶- ۴ جهش های BRAF
جهش های تک نوکلئوتید پلی مورفیسمی از نوع خطا (Mismatch)در ژن BRAF یافت می شود(۳۲).
۱ـ۵ـ۱ـ۱ـ ۶ـ۴ـ۱ سلول های جنسی
در این سلول ها هیچ جهشی در ژن BRAFیافت نشده است(۳۲).
۱-۵-۱-۱- ۶-۴-۲سلول های بدنی
برخی از جهش های ژنی را شخص در طول دوران زندگی خویش به دست می آورد و فقط در سلول های خاص مشاهده می شود. این تغییرات که جهش بدنی نامیده می شوند به ارث برده نمی شوند. جهش های سوماتیکی در ژن BRAF در چندین نوع سرطان شایع است. پروتئین نرمال BRAF در پاسخ به سیگنال ها، روشن و خاموش می شود که موجب کنترل رشد سلول و توسعه آن است. جهش های سوماتیکی پروتئین BRAF باعث می شود که پروتئین BRAF به طور مداوم فعال باشد و باعث انتقال مداوم پیام ها به هسته می شودحتی اگر سیگنال های شیمیایی حضور نداشته باشند. پروتئین بیش فعال شده به سلول های غیر نرمال اجازه ی رشد و تقسیم غیر قابل کنترل می دهد و به این صورت باعث رشد تومور می شود. شایع ترین جهش ژنی BRAF که در سرطان های انسانی پیدا می شود، باعث تبدیل اسیدآمینه، والین به اسید گلوتامیک در موقعیت ۶۰۰ پروتئین BRAF می شود که به صورت V600Eیا Val600Glu نوشته می شود.
این جهش به طور غالب در سرطان پیشرفته ی پوست که ملانوما نامیده می شود، وجود دارد. همچنین در سرطان های کلون، راست روده، تخمدان، غده تیروئید و غیره دیده می شود.
چندین نوع جهش سوماتیک دیگر نیز در ژن BRAF که با سرطان مرتبط است وجود دارد و شاملT599I ، K601E ، F599L و… است.
۸۰% این جهش ها شامل جهش متقاطع نقاط داغ T1799A است که باعث جایگزینی V600E می شود. ۲۰% بقیه در ناحیه غنی از Gly در GLOOP در اگزون شماره ۱۱ یا در فعال سازی قطعه ای در اگزون شماره ۱۵۰ نزدیک V600 است.
جهش V600E در BRAF همزمان با جهش در NRAS اتفاق نمی افتد(۳۲).
۱-۵-۱-۱- ۶-۴- ۳تومورهایی که BRAFدر آن ها موثر است
جهش در BRAFدر ۷۰% سرطان ملانوما، ۳۰% آدنوکارسینوماهای سروزتخمدان، ۵۰% سرطان تیروئید، ۸۰% سرطان های کلورکتال قابل مشاهده است(۳۲).
شکل۱-۱۲: جهش های BRAF یافته شده در سرطان ملانوما:طرح شماتیک از ساختار ابتدایی B-RAF که دمین های عملکردی و موقعیت ۳۲ موارد مشاهده شده در سرطان ها در ژن B-RAF را نشان می دهد. جایگزینی های اسید آمینه های ایجاد شده را براساس میزان فعالیت آن ها به صورت رنگی نشان داده اند(۳۲)
۱ـ ۶ اهداف تحقیق شامل اهداف اصلی، جانبی، کاربردی.
۱ـ۶ـ ۱ هدف اصلی:
بررسی ارتباط بین پلی مورفیسم شایع جهش (V600E) در ژن B RAF و ابتلا به میوم
۱ـ ۶ـ۲ هدف جانبی:
بررسی میزان شیوع جهش V600 E در ژن B RAF در افراد مبتلا به میوم وافراد نرمال
۱ـ ۶ـ ۳ هدف کاربردی:
استفاده از نتایج به دست آمده در شناسایی مارکرهای مولکولی تشخیصی میوم
۱ـ۷ فرضیه ها:
جهش در کدون ۶۰۰ (V600E) در ژن B RAF با ابتلاء به میوم ارتباط معنی دار دارد.
۱ـ۸ ضرورت های خاص :
شیوع بالای ابتلاء به میوم و ارتباط آن با ابتلاء به سرطانهای زنان نیاز به غربالگری زود هنگام میوم در افراد پرخطر را ضروری ساخته و در این راستا نیازمند مارکرهای گویا می باشیم.
