از متداول ترین روش ها برای آنالیز ترکیبات فرار گیاهی، استفاده از کروماتوگرافی گازی (GC) است. در این کروماتوگرافی‌ نمونه تبخیر و به سر ستون کروماتوگرافی ترزیق می‌شود. شویش با جریانی از فاز متحرک گازی بی‌اثر انجام می‌شود. برعکس اکثر انواع دیگر کروماتوگرافی، فاز متحرک با مولکول‌های آنالیت برهم‌کنش ندارد و فقط به عنوان وسیله‌ای برای گذار مولکول‌ها از داخل ستون عمل می‌کند. کروماتوگرافی گاز- مایع کاربرد گسترده‌ای در تمام رشته‌های علوم دارد و معمولاً با نام مختصر کروماتوگرافی گازی نامیده می‌شود. این کروماتوگرافی بر پایه تقسیم آنالیت بین یک فاز متحرک گازی و یک فاز تثبیت شده بر سطح یک جامد بی‌اثر بنا شده است.

۱-۴-۱- اجزای اصلی دستگاه کروماتوگرافی گازی

۱-۴-۱-۱- مخزن گاز حامل

گازهای حامل که باید از نظر شیمیایی بی‌اثر باشند، عبارتند از هلیم، نیتروژن، و هیدروژن. انتخاب گاز معمولاً با توجه به آشکارساز به کار رفته انجام می‌شود. به همراه مخزن گاز، شیرهای تنظیم فشار، اندازه‌نماها و‌جریان‌سنج‌‌ها در دسترس قرار می‌گیرند.

۱-۴-۱-۲- سیستم تزریق نمونه

کارایی ستون به این نیاز دارد که اندازه نمونه مناسب باشد و به صورت توپی از بخار وارد شود؛ تزریق آهسته مقدار زیاد نمونه سبب پهن شدن نوار و کاهش تفکیک می‌شود. متداول‌ترین روش تزریق نمونه، استفاده از یک ریزسرنگ برای تزریق نمونه‌های مایع یا گازی از طریق یک درپوش غشایی خودبند یا دیافراگم لاستیکی سیلیکونی به درون دریچه تبخیرکننده آنی نمونه است که در سر ستون قرار دارد.

۱-۴-۱-۳- ستون ‌وآون‌ستون

در کروماتوگرافی گاز-مایع دو نوع ستون داریم؛ لوله‌پرشده و لوله‌باز یا مویین. طول ستون‌های کروماتوگرافی از کمتر از ۲ متر تا۵۰ متر یا بیشتر تغییر می‌کند. ستون‌ها از فولاد زنگ‌نزن، شیشه، سیلیس ‌جوش‌نخورده یا تفلون ساخته می‌شوند. برای جا دادن ستون‌ها در داخل آون‌های دماپای، معمولاً به شکل حلقه‌های با قطر ۱۰تا۳۰ سانتی‌متر ساخته می‌شوند.
دمای ستون متغیری مهم است که باید تا چند دهم درجه برای انجام کارهای دقیق کنترل شود و بنابراین ستون معمولاً در یک آون دماپا جا داده می‌شود. بهترین دما برای ستون به نقطه جوش نمونه و درجه جداسازی مورد نیاز بستگی دارد.تقریباً دمای معادل یا کمی بالاتر از متوسط نقطه جوش نمونه، به یک زمان شویش مناسب منجر می‌شود. برای نمونه‌های با گستره وسیع نقطه جوش، برنامه‌ریزی دما به کار گرفته می‌شود که در آن دمای ستون به طور پیوسته و یا مرحله‌ای افزایش می‌یابد، همچنان‌که جداسازی انجام می‌شود.

۱-۴-۱-۴- سامانه آشکارساز

طی توسعه کروماتوگرافی گازی، آشکارسازهای زیادی مورد بررسی قرار گرفته است؛ آشکارسازها نه تنها برای آشکارسازی حضور آنالیت‌ها در انتهای ستون به کار می‌روند بلکه همچنین اطلاعاتی در رابطه با تعیین هویت آنها در اختیار می‌گذارند.

آشکارساز یونش شعله^[۳۹] (FID)

از متداول‌ترین آشکارسازهای مورد استفاده که عموماً برای کروماتوگرافی گازی اعمال‌پذیر است. سیال خروجی از ستون با هیدروژن مخلوط و سپس به طور الکتریکی مشتعل می‌شود. اکثر ترکیبات آلی، موقعی که در دمای شعله هیدروژن/هوا تفکافت شوند، یون‌ها و الکترون‌هایی تولید می‌کنند که الکتریسیته را از درون شعله هدایت می‌کنند. پتانسیلی چند صد ولتی در عرض نوک مشعل و الکترود جمع کننده در بالای شعله اعمال می‌شود. سپس جریان الکتریکی حاصل برای اندازه‌گیری به تقویت‌کننده عملیاتی با آمپدانس بالا هدایت می‌شود. یونش ترکیبات کربن در شعله، فرایندی است که کاملاً درک نشده است. اگرچه مشاهده شده که تعداد یون‌های تولیدی تقریباً متناسب با تعداد اتم‌های کربن کاهیده شده در شعله است. از آنجایی‌که آشکارساز یونش شعله‌ای به تعداد اتم‌های کربن وارد شده به آشکارساز در واحد زمان جواب می‌دهد؛ وسیله‌ای حساس به جرم است تا حساس به غلظت.
آشکارساز یونش شعله‌ای حساسیت بالا، گستره جواب خطی وسیع و نوفه کم از خود نشان می‌دهد و عیبش این است که نمونه را تخریب می‌کند.

۱-۴-۲- کروماتوگرافی گازی/طیف‌سنج جرمی (GC-MS)

چند سازنده، دستگاه کروماتوگراف گازی عرضه می‌کنند که مستقیماً می‌تواند به انواع مختلف طیف‌سنج‌های جرمی با پویش سریع متصل ‌شود. سرعت جریان از ستون مویین عموماً به اندازه‌ای کم است که خروجی از ستون را می‌توان به طور مستقیم به محفظه یونش طیف‌سنج جرمی خوراند. اکثر طیف‌سنج‌های جرمی با قطاع مغناطیسی و چهارقطبی قابلیت اتصال به کروماتوگراف گازی را دارند.

۱-۴-۲-۱- طیف‌سنج جرمی چهارقطبی^[۴۰]

این طیف‌سنج جرمی معمولاً فشرده‌تر، ارزان‌تر ومحکم‌تر از مشابه‌های قطاع مغناطیسی خود هستند. از محاسن این دستگاه‌ها آن است که زمان‌های رانش پایینی دارند (ms100>) که این امر به‌ویژه برای پویش بی‌درنگ پیک‌های کروماتوگرافی مفید است.
قلب دستگاه چهار قطبی، چهار میله استوانه‌ای موازی است که به عنوان الکترود به کار می‌روند.میله‌های مقابل یکدیگر از نظر الکتریکی متصل شده‌اند؛ یک زوج به پایانه مثبت منبع dc^[41] متغیر و زوج دیگر به پایانه منفی متصل می‌شود. علاوه براین، پتانسیل‌های ^[۴۲]ac با فرکانس رادیویی که ۱۸۰درجه خارج از فازند، به هر زوج از میله‌ها اعمال می‌شوند. برای به ‌دست آوردن یک طیف جرمی با این وسیله، یون‌ها با پتانسیل ۵ تا ۱۰ ولت به درون فضای بین میله‌ها شتاب داده می‌شود. در این هنگام، ولتاژهای ac وdc روی میله‌ها هم‌زمان افزایش می‌یابند، درحالی که نسبت آنها ثابت باقی می‌ماند. در هر لحظه معین، تمام یون‌ها به آنهایی که مقدار مشخص m/z دارند، به میله‌ها برخورد می‌کنند و به مولکول‌های خنثی تبدیل می‌شوند. بنابراین یون‌ها با گستره محدودی از مقادیر m/z به ترانسدیوسر می‌رسند و به طور کلی دستگاه‌های چهارقطبی به سهولت یون‌هایی را تفکیک می‌کنند که جرم آنها با یک واحد متفاوت است [۳۲].

۱-۴-۳- شاخص بازداری کواتس^[۴۳]

شاخص بازداری کواتس (I) اولین‌بار در سال ۱۹۵۸ توسط کواتس به عنوان یک پارامتر برای شناسایی مواد حل‌شده با بهره گرفتن از کروماتوگرام‌ها تعریف شد. شاخص بازداری هر ماده حل‌شده با بهره گرفتن از مخلوطی از اجسام حل‌شده را می‌توان با حداقل دو آلکان نرمال که زمان بازداری آنها در دو طرف زمان بازداری ماده حل‌شده قرار دارد؛ به‌دست آورد. آلکان‌های نرمال، استانداردهایی هستند که درجه‌بندی شاخص بازداری بر پایه آنها بنا شده است. بنا برتعریف شاخص بازداری یک آلکان نرمال برابر ۱۰۰ ضربدر تعداد کربن‌های موجود در ترکیب، بدون توجه به مواد پرکننده ستون، دما و سایر شرایط کروماتوگرافی درنظر گرفته شود. شاخص بازداری برای تمام ترکیبات علاوه بر آلکان نرمال، اغلب اوقات با متغیرهای ستون، چند صد واحد شاخص بازداری تغییر می‌کند.
از مدت‌ها قبل مشخص شده است که در بین یک سری ترکیبات همرده، نمودار لگاریتم زمان بازداری تنظیم شده بر حسب تعداد اتم‌های کربن، اگر پایین‌ترین عضو سری حذف شود، خطی است. معمولاً روش نموداری برای تعیین شاخص‌های بازداری لازم نیست. در مقابل، داده‌های زمان بازداری تعیین شده از درون‌یابی کروماتوگرام مخلوطی از ماده حل‌شده مورد نظر و دو یا چند استاندارد آلکان نرمال به دست می‌آید.
بازگویی این مطلب مهم است که شاخص بازداری برای یک آلکان نرمال مستقل از دما و مواد پرکننده ستون است. ولی شاخص بازداری تمام مواد حل‌شده دیگر، اغلب از ستونی به ستون دیگر تغییر می‌کند. سیستم شاخص بازداری، این امتیاز دارد که برپایه مواد مرجعی بنا شده است که به آسانی در دسترس قرار دارند. وگستره نقطه جوش وسیعی را می‌پوشانند علاوه براین، وابستگی شاخص بازداری آنهابه دما نسبتاً خیلی کم است [۳۲].کواتس رابطه لگاریتمی را برای محاسبه شاخص بازداری پیشنهاد کرد که برای آنالیز GC در دمای ثابت به کار می‌رود:
محققی دیگر رابطه فوق را برای آنالیز GC با برنامه‌ریزی دمایی به صورت زیر فرموله کرد [۳۲ و ۳۳]:

I : شاخص بازداری برای آنالیز GC در دمای ثابت

I^T : شاخص بازداری برای آنالیز GC با برنامه‌ریزی دمایی
: t́_Riزمان بازداری تصحیح شده برای پیک نمونه
t́_RZ : زمان بازداری تصحیح شده برای n-آلکان خروجی قبل از پیک نمونه
t́_{R (Z+1):} زمان بازداری تصحیح شده برای n-آلکان خروجی بعد از پیک نمونه
:Z تعداد کربن پیک –nآلکان خروجی قبل از پیک نمونه
t^T_Ri: زمان بازداری پیک نمونه
t^T_RZ: زمان بازداری برای n-آلکان خروجی قبل از پیک نمونه
t^T_{R (Z+1):} زمان بازداری برای n-آلکان خروجی بعد از پیک نمونه

۱-۵- ارزیابی سمیت سلولی^[۴۴]

سرطان به عنوان یکی از مهم ترین عوامل مرگ و میر درجهان محسوب می شود و همه ساله منجر به مرگ بیش از ۶ میلیون نفر می شود. امروزه مبارزه با سرطان، به خصوص در مورد تومورهایی که رشد سریع دارند با توفیق نسبتاً خوبی همراه بوده است. درمان سرطان به دلیل محدودیت‌های بنیادی با مشکلات زیادی مواجه بوده است . به منظور دست‌یابی به ترکیبات دارای خاصیت ضدسرطان نیاز به یک سری آزمون های غربالگری است. از آنجایی که تحقیقات در زمینه دست‌یابی به ترکیبات ضد سرطان از منابع گیاهی هر روزه ابعاد گسترده‌تری پیدا می‌کند؛ کشف داروهایی مانند آلکالوئیدهای حاصل از ‌گیاه پروانش^[۴۵] یا دی‌ترپن تاکسول از پوست درخت سرخدار^[۴۶] که در درمان سرطان مورد استفاده قرار می گیرند؛ انگیزه مضاعفی را برای تحقیق در زمینه جستجوی داروهای ضدسرطان با منشأ گیاهی ایجاد کرده است. در این مطالعات آزمون های سمیت سلولی به دلیل سرعت بخشیدن به روال تحقیق و صرف هزینه های کمتر برای جستجوی ترکیبات سیتوتوکسیک استفاده می‌شود. یکی از معتبرترین این آزمون‌ها، آزمون سمیت میگوی آب شور یا سمیت لارو میگوی آب شور «آرتمیا سالینا^[۴۷]» می‌باشد که مورد تأیید موسسه ملی سرطان درآمریکا (NCI)^[48] است. این آزمون با بهره گرفتن از لارو میگوی‌آب شور، برای ارزیابی اولیه سمیت انواعی از عصاره‌های گیاهی، فلزات سنگین، حشره‌کش‌ها، افزودنی‌های مواد غذایی و یا ترکیبات دارویی به کار می‌رود [۳۴].
آرتمیا صدها میلیون سال است که بر روی کره زمین زیست می کند و در حال حاضر در ۵۰۰ دریاچه شور مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان یافت می‌شود. در شرایط طبیعی این موجودات تولید سیست می‌کنند. سیست‌های آنها دارای یک پوسته و پوشش غشایی در اطراف جنین است. این سیست‌ها به‌طور معمول دارای ۶ تا ۱۰ درصد رطوبت و دارای قابلیت بقا تا ۵۰ سال می‌باشند. سیست‌ها پس از قرار گرفتن در آب دریا برای ۱۵-۲۰ ساعت تولید موجوداتی به نام لارو یا ناپلی^[۴۹] می‌کنند که در حدود ۵/۲ میلی‌متر طول داشته و دارای یک جفت چشم می‌باشند. ۱۲ ساعت پس از تفرج، لارو وارد مرحله دوم میشود. در حدود دو هفته طول می‌کشدتا ناپلی‌ها بالغ گردند.
اگرچه آزمون آرتمیا سالینا برای تفسیر و توضیح مکانیسم‌های سمیت کافی نیست اما یک روش مفید در ارزیابی مقدماتی و تعیین سمیت ترکیبات مختلف آنها است. این روش نیازمند تجهیزات پیچیده و فن آسپتیک نیست. آزمون آرتمیا سالینا قابل اطمینان، سریع، ارزان و اقتصادی است . از این آزمون در تست‌های غربالگری و جداسازی ترکیبات سیتوتوکسیک فعال گیاهان و شناسایی بیشتر آنها استفاده می‌گردد [۳۵ و ۳۶].

۱-۶- فعالیت ضد میکروبی

یکی از مشکلات عمده ای که بشر از ابتدای خلقت با آن دست به گریبان بوده بیماری‌های عفونی است . با توجه به پدیده بروز مقاومت میکروبی در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها ضرورت دست‌یابی به ترکیبات طبیعی با فعالیت ضد میکروبی بیشتر احساس می‌گردد . از آنجایی که برخی عصاره‌های گیاهی و ترکیبات شیمیایی آنها دارای اثرات ضدمیکروبی بوده و برای درمان عفونت‌ها به کار می‌روند، بررسی گیاهان با این هدف ضروری به نظر می‌رسد. در ابتدا به معرفی کلی دو دسته از میکروارگانیسم‌‌ها (باکتری‌ها و قارچ‌ها) می‌پردازیم.

۱-۶-۱- میکروارگانیسم ‌ها

۱-۶-۱-۱- باکتری‌ها

باکتری‌ها به عنوان ارگانیسم‌های دارای ساختمان سلول‌های پروکاریوت تعریف می‌شوند. اینها شامل باکتری‌های حقیقی، سیانوباکتری‌ها (قبلاً جلبک‌های سبز آبی نامیده می‌شدند.) و آرکی‌باکتری‌ها (اخیراً تحت عنوان گروهی شناخته می‌شوند که شامل متانوژن و سایر ارگانیسم‌هایی هستند که به‌نظر می‌رسد از نظر سیر تکاملی از سایر باکتری‌ها مجزا می‌باشند) هستند.گروه‌های تاکسونومیک باکتری‌ها عمدتاً براساس ویژگی‌های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی تشخیص داده می‌شوند. همچنین باکتری ها بر اساس توانایی افتراقی در رنگ آمیزی با کریستال ویوله- ید به دنبال افزودن حلال‌های آلی نظیر الکل یا استون به دو دسته گرم مثبت^[۵۰] و گرم منفی^[۵۱] تقسیم می شوند. واکنش مختلف این دو گروه نسبت به رنگ آمیزی گرم مربوط به تفاوت های اساسی در ساختار و ترکیب دیواره آنهاست. [۳۷].

۱-۶-۱-۲- قارچ‌ها

قارچ‌ها میکروارگانیسم‌های یوکاریوت هتروتروف می‌باشند. اینها بدون کلروفیل هستند. زندگی انگلی یا ساپروفیتی دارند. اینها می‌توانند تک‌سلولی باشند اما بیشتر ساختمان‌های رویشی رشته‌ای دارند که معمولاً به وسیله دیواره سلولی ساخته شده از کیتین یا سایر پلی‌ساکاریدها احاطه می‌شوند. تکثیر به‌وسیله اسپور انجام می‌شود و به‌ طور معمول قارچ‌ها دو نوع تکثیر جنسی و غیرجنسی را نشان می‌دهند. طبقه‌بندی قارچ‌ها بیشتر براساس تکثیر آنها استوار است که شامل ماهیت چرخه زندگی، ساختمان‌ها و اسپورهای تکثیر می‌باشد. به‌طور قراردادی مخمرها به‌عنوان اجزای جداگانه‌ای از قارچ‌ها شناخته نمی‌شوند و به همراه اشکال رشته‌ای مکملشان طبقه‌بندی می‌شوند. عمدتاً مخمرها به طور تیپیک از قارچ‌های رشته‌ای در سیستم طبقه‌بندی و سیستم شناسایی مجزا می‌باشند [۳۷].

۱-۶-۲- محیط‌های کشت میکروبی

محیط‌های کشت معمولاً با نام‌های غیرانتخابی، انتخابی، افتراقی‌ و انتخابی- ‌‌افتراقی تعریف می‌شوند.محیط‌های کشت غیرانتخابی از نظر مواد مغذی غنی و معمولاً برای شمارش مجموع کل یا برای انتقال و نگه‌داری میکروارگانیسم‌های خالص شده مورد استفاده قرار می‌گیرند. یک محیط کشت انتخابی تنها به میکروارگانیسم‌های خاص (میکروارگانیسم‌های هدف) اجازه رشد داده و باعث مهار رشد میکروارگانیسم‌های رقیب می‌گردند.عوامل انتخابی مناسب (نظیر: کریستال ویوله که عامل انتخابی علیه باکتری‌های گرم مثبت است.) برای این نوع از محیط‌های کشت ضروری می‌باشد. محیط‌های کشت افتراقی معمولاً برای تمایز جمعیت‌های میکروبی موجود در نمونه ماده غذایی با خصوصیات بیوشیمیایی مشابه است. باکتری‌های پروتئولیتیک و غیرپروتئولیتیک، لیپولیتیک و غیرلیپولیتیک، تولیدکننده‌های اسید و غیرتولیدکننده‌ اسید توسط یک محیط افتراقی ساده و با بهره گرفتن از مواد افتراقی مناسب شناسایی و شمارش می‌شوند. یک محیط کشت حاوی هر دو عامل انتخابی و افتراقی باعث می‌گردد تا در محیط پیچیده میکروارگانیسم‌ها، میکروارگانیسم دلخواه و هدف انتخاب و تشخیص داده شود. محیط‌های کشت به صورت‌های مایع (براث)^[۵۲] و جامد (آگار)۲ براساس اهداف مورد آزمایش استفاده می‌گردند [۳۸].
تلقیح روی محیط‌های آگاردار شامل روش‌هایی نظیر کشت خطی، پورپلیت و کشت پر (منتشر) است. این امکان وجود دارد که روش‌های تلقیح روی تفسیر داده‌ها و نتایج تأثیر بگذارند. به‌عنوان مثال: با بهره گرفتن از روش کشت خطی تنها اطلاعات کیفی بدست می‌آید ولی با کشت پورپلیت و کشت پر، اطلاعات برای شمارش میکروارگانیسم‌ها به دست می‌آید (اطلاعات کمی). کشت پلیت به روش خطی شامل روش‌های معمول ذیل است.
۱-استریک ‌کردن‌ به ‌روشT
۲-استریک ‌کردن‌ به‌ روش ‌چهار قسمتی