آسیب سلول های آسینار پانکراس ، التهاب یا انسداد در مجاری پانکراس یا مجرای صفراوی سبب برگشت آمیلاز به داخل بافت پانکراس می شود. سپس آمیلاز از طریق وریدچه ها وعروق لنفاوی جذب خون می گردد و سبب افزایش سطح آمیلاز در خون می شود. کلیه به سرعت آمیلاز را تصفیه می کند و در نتیجه سطح آمیلاز در ادار افزایش می یابد. سطح افزایش یافته ی آمیلاز در خون هیپرآمیلازی نامیده می شود. برای مثال در پانکراتیت حاد، مقدار آمیلاز سرم در مدت ۱۲-۲ ساعت شروع به افزایش می کند در مدت ۷۲-۱۲ ساعت به اوج می رسد و در عرض ۴-۳ روز به علت تصفیه آن توسط کلیه ها به وضعیت طبیعی می گردد. در واقع سطح آمیلاز سرم ۲-۱ روز بعد از بهبود مرحله ی حاد بیماری به حد طبیعی برمی گردد اما در سطح آمیلاز ادرار ۷-۵ روز پس آغاز بیماری بالا باقی می ماند این امر به تشخیص پانکراتیت پس از بازگشت سطح سرمی آن به حالت طبیعی کمک می کند. آزمون آمیلاز ادرار و سرم هر دو آزمون های حساسی هستند اما برای اختلالات پانکراس اختصاصی نیستند، سایر بیماری های غیر پانکراسی هم می توانند سطح آمیلاز را در سرم وادرار بالا ببرند. برای مثال در التهاب حاد غدد پاروتید مانند اوریون و نیز در انفارکتوس کلیه، بارداری خارج رحمی، انسداد روده، ایسکمی مزانتر و اختلالات وخیم روده ای هم مقدار آمیلاز افزایش می یابد پس باید علاوه بر آن آزمون ها به علایم بیماری هم توجه ویژه داشت(۹).
در افراد مبتلا به موکوویسیدوز که یک بیماری مادر زادی پانکراس است سطوح آمیلاز سرم کاهش می یابد.افزایش آمیلاز خون به همراه کاهش یا نرمال بودن آمیلاز ادرار می تواند مطرح کننده اختلال در عملکرد کلیه و یا حضور ماکروآمیلاز (آمیلاز باند شده به پروتئینهای خون) در خون باشد که این وضعیت آخر نمی تواند مطرح کننده بیماری خاص باشد(۹).
در پانکراتیت حاد معمولاً افزایش آمیلاز ، همسو با افزایش آنزیم دیگری به نام لیپاز می باشد و اغلب در تشخیص این بیماری اندازه گیری هر دو آنزیم با یکدیگر در خواست می شود ولی در پانکراتیت مزمن که معمولاً به دلیل الکلیسم و یا ناهنجاری های ژنتیکی مانند سیستیک فیبروزیس اتفاق می افتد میزان آمیلاز به صورت متوسط افزایش می یابد و یا در موارد آسیب و از بین رفتن سلولهای سازنده آمیلاز میزان این آنزیم کاهش می یابد.در اندازه گیری آمیلاز باید توجه داشت که داروهایی مانند آسپیرین، ضد بارداری های خوراکی، استروئیدها مانند کورتیکوستروئیدها، ایندومتاسین و همچنین داروهای مدر باعث افزایش آمیلاز می شود(۹).

دانلود متن کامل پایان نامه در سایت fumi.ir

۲-۲- آلفا آمیلاز:

آلفا آمیلاز (EC 3.2.1.1) نوعی آنزیم است که اتصالات آلفای پلی ساکارید های بزرگ دارای پیوند آلفا، مانند نشاسته و گلیکوژن را به گلوکز و مالتوز هیدرولیز می کند(۴۵). آلفا آمیلاز بیشترین فرم آمیلاز موجود در انسان ها و PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران می باشد. البته آلفا آمیلاز در بعضی دانه های گیاهی حاوی نشاسته حضور دارد و توسط بسیاری از قارچ ها هم ترشح می شود(۷۱).
آلفا آمیلاز یک متالوآنزیم است که حداقل دارای یک یون Ca2+ می‌باشد و بدون حضور کلسیم نمی‌تواند به طور کامل فعال باشد. تعداد یون Ca2+ از یک تا ده متفاوت است(۴۱). (شکل۲-۱)

[۳]شکل ۲- ۱- نمایی شماتیک از آلفا آمیلاز یون کلسیم به رنگ خاکی و یون کلرید به رنگ سبز است.

۲-۲-۱-کارکرد آلفاآمیلاز :

آلفاآمیلاز زنجیره کربوهیدراتی نشاسته را در مکان‌های تصادفی هیدرولیز کرده و تولید الیگوساکاریدهای کوتاه، مالتوز و گلوکز می‌کند. این واکنش بوسیله افزایش میزان قندهای احیا و کاهش رنگ آبی و یا از طریق تست برنفلد و تولید رنگ زرد قهوه‌ای در کمپلکس ید و نشاسته پایش می‌شود. براساس سیستم طبقه‌بندی که براساس شباهت توالی آمینو اسیدی طراحی شده است اکثر آنزیم‌های تجزیه کننده نشاسته از جمله آلفا آمیلازها در خانواذه ۱۳ گلیکوزیل هیدرلازها قرار می‌گیرند. آلفا آمیلازها دارای چهار ناحیه حفاظت شده در توالی اولیه خود می‌باشند، برخی از این نواحی حفاظت شده مربوط به جایگاه فعال‌اند و برخی در پایداری ساختار سوم حفاظت شده نقش دارند. آلفا آمیلازها دارای یک ساختار۸β/α))یا[۴] TIM barrel (بشکهβ/α) می‌باشند. یک سری قوس‌های β-α-β طوری آرایش می‌یابند که نتیجه آن ایجاد یک ساختمان پایدار می‌باشد، این موتیف را بشکهβ/α می‌نامند(۹).
آلفا آمیلاز یک آنزیم القاپذیر است که معمولاً در حضور نشاسته و محصولات هیدرولیزی نشاسته مانند مالتوز القا می‌شود. آلفا آمیلاز همانند سایر آنزیم‌های القاپذیر در حضور گلوکز و سایر قندها تحت تاثیر مهار کاتابولیک قرار می‌گیرد(۹).

۲-۲-۲- آلفا آمیلاز در فیزیولوژی انسان:

اگرچه آمیلاز در بسیاری از بافت های بدن یافت می شود اما عمدتا در بزاق و مایع پانکراس (لوزولمعده) به وفور یافت می شود که هر یک دارای ایزوفرم آلفا آمیلاز انسانی مخصوص خود می باشند. آنها در فشار ایزوالکتریکی رفتار های متفاوتی دارند ، و همچنین می توانند در آزمایش با بهره گرفتن از آنتی بادی مونوکلونال جدا شوند. در انسان، همه ایزوفرم های آمیلاز مرتبط به کروموزوم ۱p21 می باشند (۶۷).

۲-۳- آمیلاز بزاقی یا ptyalin :

آمیلاز در بزاق یافت می شود و نشاسته را به مالتوز و دکسترین می شکند. این شکل از آمیلاز “ptyalin”یا “ماده تخمیری بزاق” نیز نامیده می شود(۴۴). این آنزیم در بزاق مولکول های بزرگ و غیر حلال نشاسته را به نشاسته ی حلال (آمیلودکسترین، اریترودکسترین و آکرودکسترین) می شکند، که منجر به تولید قطعات کوچکتر از نشاسته و در نهایت مالتوز می گردد. Ptyalin بر اتصالات خطی α ۱)به(۴ گلیکوزیدی عمل می کند اما هیدرولیز کامل ترکیب نیازمند آنزیم اثر کننده بر ترکیبات شاخه دار می باشد. آمیلاز بزاقی در معده توسط اسید معده غیر فعال می گردد. pH مایع معده حدود ۳/۳ است و ptyalin بمدت ۲۰ دقیقه در درمای °C37 کاملا غیر فعال می شود(۱۷).

۲-۳-۱- تنوع ژنتیکی در آمیلاز بزاقی:

ژن آمیلاز بزاقی در طول تکامل تحت تکثیرقرار گرفته، و مطالعات هیبریداسیون DNA نشان می دهد که افراد بسیاری دارای چندین تکرار پشت سر هم ژن می باشند. تعداد کپی های این ژن مرتبط با میزان های آمیلاز بزاقی می باشند که با بهره گرفتن از تکنیک های وسترن بلاتینگ و آنتی بادی های مخصوص آمیلاز انسانی اندازه گیری شده اند(۷۸).

۲-۴- آلفا آمیلاز پانکراس:

آلفا آمیلاز پانکراس به طور تصادفی اتصالات خطی α ۱)به(۴ گلیکوزیدی آمیلوز را می شکند که نهایتا محصول آن دکسترین، مالتوز یا مالتوتریوز می باشد(۹).

۲-۵- آلفا آمیلاز در پاتولوژی:

آزمایشات پزشکی معمولا هم آمیلاز پانکراسی و هم آمیلاز کل را اندازه گیری می کنند. انجام تست مربوط به بررسی آمیلاز در مقایسه با لیپاز آسان تر است.از آنجایی که میزان موجود این آنزیم در خون کم است، زمان تست هنگام گرفتن نمونه خونی برای این اندازه گیری بسیار حیاتی می باشد. خونگیری باید بلافاصله (سریعترین زمان ممکن) پس از درد پانکراسی گرفته شود در غیر این صورت به سرعت توسط کلیه ها دفع می شود.آلفا آمیلاز بزاقی به عنوان بیومارکری برای تشخیص استرس استفاده می شود که نیازی به خون گیری ندارد(۹).

۲-۵-۱- تفسیر میزان آلفا آمیلاز:

افزایش میزان پلاسمایی آلفا آمیلاز در انسان در موارد زیر یافت می شود:

ترومای بزاقی (شامل لوله گذاری بیهوشی)

اوریون – به دلیل التهاب غدد بزاقی

پانکراتیت – به دلیل صدمه به سلول های تولید آمیلاز

نارسایی کلیوی – به علت کاهش دفع

استرس

خواندن آمیلاز نهایی بالای ۱۰ برابر از محدوده ی نرمال (ULN[5]) احتمالا به دلیل بیماری پانکراس یا پانکراتیتیس می باشد. ۵ تا ۱۰ برابر میزان طبیعی ممکن است نشان دهنده [۶]ایلئوس یا بیماری اثنی عشر و یا نارسایی کلیوی باشد، و میزان کمتر از نرمال، عموما در بیماری های غدد بزاقی یافت می شود (۶۳و۴و۱۳).

۲-۶- بافر محدود کننده آلفا آمیلاز:

مولکول تریس به عنوان مهار کننده تعدادی از α-آمیلاز های باکتریایی گزارش شده است(۲۰و۲)، از این رو بهتر است در زمان انجام مطالعه یا به کاربردن آنزیم از بافر تریس استفاده نشود.

۲-۷- مطالعه فعالیت آنزیم:

بسیاری از روش های اندازه گیری فعالیت آلفا آمیلاز برای بررسی آنزیم موجود در مایعات بدن یا عصاره های برگرفته از دانه های گیاهی طراحی شده است.
روش های رنگ سنجی بر اساس اندازه گیری رنگ آبی نشاسته – ید است که توسط فووا در دهه پنجاه میلادی ابداع شد تا آن زمان تمام متدهای اندازه گیری آمیلاز در یکی از این سه روش خلاصه می شد؛ یدومتریک، ساکاروژنیک و ویسکومتریک(۱۹).

۲-۷-۱- روش های اندازه گیری فعالیت آلفاآمیلاز تا قبل از روش رنگ سنجی:

در روش یدومتریک ، فعالیت آمیلاز به صورت زمان لازم برای یک نمونه آنزیم مجهول جهت تبدیل سوبسترای بیرنگ از محلول آبی کمپکس نشاسته- ید، بیان می شود. این روش زیاد قابل اعتماد نبود زیرا غلظت آنزیم با کاهش رنگ رابطه خطی نداشت، همچنین رنگ آبی تحت تأثیر دما و عوامل دیگر پایداری خود را از دست می داد(۷۳).
روش ساکاروژنیک بر اساس اندازه گیری گروه های احیاکننده تولید شده در اثر عمل هیدرولیز نشاسته طراحی شده بود. بنابراین با اندازه گیری قدرت کاهندگی محلول آنزیم – سوبسترا قبل و بعد از انکوباسیون، فعالیت آنزیم را اندازه می گرفتند. کاهندگی با بهره گرفتن از ترکیبات مس سنجیده می شد و به صورت میلی گرم گلوکوز آزاد شده بیان می شد(۶۲). محدودیت آن، مداخله عوامل احیا کننده فرعی درمحیط بود که در سرم بیماران دیابتی کنترل این مسأله مشکل زا است و از طرفی آماده سازی سوبسترا نیز مشکل بود.
در روش ویسکومتریک که توسط دیویسون معرفی شد(۱۵)، کاهش وزن مولکولی نشاسته که در ویسکوزیته محلول مؤثراست، اساس سنجش بود. این اندازه گیری در ویسکوزیمتر «استوالد» انجام می شد. زمان لازم برای کاهش ویسکوزیته تا بیست درصد، بیانی از فعالیت آنزیم بود (۱۶).
زمان انکوباسیون حتماً متغیر بود زیرا سیالیت رابطه ای خطی با زمان ندارد؛ سرم حاوی آنزیم موردنظر، کمی ویسکوز است پس تداخل اجتناب ناپذیر بود (۲۹).

۲-۷-۲ – روش های رنگ سنجی:

روشی که توسط فووا ابداع شده، خیلی استفاده می شود و بر اساس رنگ حاصل از اتصال ید با پلیمرهای نشاسته می باشد. در گزارشهای مختلف از محققان، اختلاف زیادی در غلظتهای استفاده شده ید ( از ۳ میکرومول تا ۲۵/۰ میلی مول ) و طول موجهای مورد استفاده ( از ۵۵۰ تا ۷۰۰ نانومتر) دیده می شود. چون در این روش حجم نهایی باید به ۲۰ تا ۲۰۰ میلی لیتر برسد، برای تعداد زیاد نمونه مناسب نیست. بنابراین زیائو و همکارانش بر پایه همین واکنش نشاسته با کلر، روشی را در میکروپلیت ابداع کردند(۷۶).
برنفلد (با بهره گرفتن از آمیلوپکتین سیب زمینی بعنوان سوبسترا و یک محلول دی نیتروسالیسیلیک اسید) روشی را برای اندازه گیری آلفاآمیلاز پانکراسی ابداع کرد که در آن فعالیت آنزیم توسط تعداد گروه های کاهنده ایجاد شده توسط آنزیم در طی هیدرولیز سوبسترا تعیین می شد (۵). بعد از آن اصلاحاتی روی این روش انجام شد مثلاً کانو سوبسترا را به نشاسته محلول تغییر داد(۳۳).
امروزه دو روش اصلی برای تعیین فعالیت این آنزیمها وجود دارد: یکی بر پایه اندازه گیری مقدار قندهای احیاکننده است که روش «دی نیتروسالیسیلیک اسید» و روش «نلسون – سوموگی» از این جمله اند(۵۰) ، و روش دیگر همان روش «فووا» است (۷۵).

۲-۸- معماری دمین های ساختار آلفا آمیلاز (Domain):

آلفا آمیلاز شامل تعدادی از دمینهای پروتئینی مجزا است. دمین عملکردی دارای یک ساختار شامل هشت رشته آلفا / بتا در هر بشکه است که شامل سایت فعال ، دمین متصل شونده به کلسیم می باشد(۱). چندین آلفا آمیلاز دارای یک دمین صحفه بتا یا beta-sheet domain هستند، که معمولا در پایانه C است (۳۲و۳۱). این دومین به عنوان پنج رشته آنتی پارالل ورقه بتا دسته بندی می شود (۴۲).(شکل۲-۲)

شکل ۲-۲-ساختار کریستالی آلفا آمیلاز

جو ایزوآنزیم ۱
[۷]

۲-۹- ژن های آلفا آمیلاز در انسان:

بزاقی: AMY1A, AMY1B, AMY1C

پانکراسی: AMY2A, AMY2B

آلفا آمیلاز پانکراسی توسط ژن های AMY-2A و AMY-2B و آلفا آمیلاز غدد بزاقی توسط ژن های AMY-1A وAMY-1B و AMY-1Cکد می شود که روی کروموزوم ۱p21 واقع شده اند(۲۴و۲۲). (شکل۲-۳)
آلفا آمیلاز بزاقی و پانکراسی درجه بالایی از تشابه توالی اسیدهای آمینه را دارند. ۹۷٪ شباهت در کل آنزیم و ۹۲٪ در دمین کاتالیتیک دیده می شود (۵۶و۵۴).
تحقیقات نشان داده است که ژن آمیلاز غدد بزاقی در انسان تقریبا حدود kb10 است که دارای ۱۱ اگزون و ۱۰ اینترون می باشد که اندازه اگزون ها بین bp231-100 است (۴۷).

شکل-۲-۳- جایگاه ژنی آمیلاز را روی کروموزوم ۱P21 نشان می دهد
[۸]
۱
ژن AMY-2B آلفا آمیلاز ی را کد می کند که توالی آمینو اسیدی آن بسیار مشابه با آمیلاز بزاقی(S) و پانکراسی(P) است که در بافت کارسینوئیدی ریه نیز بیان می شود. ژن AMY-2B به میزان کم در کبد انسان بیان می شود. در موش ، توالی رونوشت های P – آمیلاز به طور عمده متفاوت با آمیلاز موجود در غدد بزاقی و کبد است در حالی که رونوشت آمیلاز کبد در مقابل رونوشت S – آمیلاز فقط در انتهای توالی ۵´ متفاوت است (۸ و۳۵). ژن کاذب –actinϒ در ناحیه بالا دست ژن AMY-2B واقع شده است. در همه ژن ها به جز AMY-2B ژن کاذب –actinϒ توسط عناصری شبه رتروویروسی درونی جدا شده است.
ژن های پانکراسی در مقایسه با AMY-2A شامل باقی مانده LTR[9] سمت چپ است. وجود عناصر شبه رترو ویروسی داخلی در ارتباط با بیان آمیلاز در غدد بزاقی نشان می دهد که توالی رتروویروسی ممکن است در تنظیم توالی بزاقی شرکت داشته باشند (۴۸). رونویسی از ژن های آمیلاز پانکراسی از اگزون a شروع می شود در حالی که رونویسی از ژن های آمیلاز غدد بزاقی از اگزون غیر ترجمه(NTE[10]) با ژن کاذب –actinϒشروع می شود(۲۳ و۵۸). (شکل۲-۴)

۲-۱۰- آلفا آمیلاز در موش:

آلفا آمیلاز در موش ها توسط خانواده ای از ژن ها بر روی کروموزوم ۳ (chr 3) بیان می شود (۵۹).
AMY1 یک ژن تک نسخه ای است که در بیشتر گونه های موش بیان می شود. ناحیه AMY1 از دو پروموتور آلترناتیو در ناحیه بالادست ژن های ساختاری (kb5/4-5/7) رونویسی می شود. یکی از این پروموتورها در غده پاراتیروئید و دیگری در کبد و غده پاراتیروئید فعال است(۳۶).