تصویر ۴-۳ خوشه‌چه همراه با محور گل نر خرما، کشت بساک در محیط کشت مایع، قرار دادن پتری‌ها بر روی شیکر ۴۷
تصویر ۵-۳ خوشه‌چه‌های نر خرما، بساک گل نر، قرار دادن بساک‌ها در محیط کشت ۴۸
تصویر ۶-۳ تصویر مش، رسوب میکروسپورها در محیط کشت ایزولاسیون، تصویر لام هموسایترمری ۴۹
تصویر ۷-۳ گل آذین ماده، برش گل آذین به قطعاتی شامل ۲-۳ گلچه، کشت میوه‌های نارس در محیط کشت به ۴ صورت مختلف. ۵۰
تصویر ۸-۳ میوه نخل خرما، آندوسپرم جدا شده از پریکارپ، کشت آندوسپرم به همراه جنین و پریکارپ ۵۱
تصویر ۱-۴ تشکیل کالوس در لبه خارجی ریزنمونه‌ها، افزاش حجم کالوس در لبه خارجی ریزنمونه‌ها، تشکیل کالوس در کناره‌های رگبرگ مرکزی ریزنمونه‌ی برگی، کالوس‌زایی نسبتاً پایین در لبه‌های خارجی ریزنمونه‌ها ۵۵
تصویر ۲-۴ رنگ سبز متمایل به زرد برگ‌های قرار گرفته در تاریکی، قهوه‌ای شدن برگ‌های قرار گرفته در نور، تشکیل کالوس در لبه خرجی برگ‌ها، قهوه‌ای شدن کاوس‌های تولید شده در برگ‌های قرار گرفته در معرض نور ۵۸
تصویر ۳- ۴ نقاط سفید رنگ بر روی بساک، اندام‌زایی بر روی بساک، تولید کالوس در انتهای بساک‌ها ۵۹
تصویر ۴-۴ ظهورنقاط سفید رنگ برروی بساک، ظهور رنگ سفید گچی در بساک‌های کشت شده در روز پنج‌ام، ظهور نقاط برجسته و متورم در بساک‌ها، تغییر رنگ‌ محیط‌های کشت در بساک‌های کاشته شده در روز‌های متفاوت، انتقال بساک‌ها به محیط کشت نیمه جامد. ۶۰
تصویر ۵ -۴ کالوس تولید شده از بساک، جنین تولید شده از بساک. ۶۳
تصویر ۶-۴: تشکیل کالوس سفید رنگ در ترکیب تیماری ۲ (۵ میلی‌گرم در لیتر ۲,۴-Dو TDZ)، سفید شدن میوه‌ها، تشکیل جنین در ترکیب تیماری ۱ (۵ میلی‌گرم در لیتر TDZ)، افزایش حجم کالوس در ترکیب تیماری ۲ (۵ میلی‌گرم در لیتر ۲,۴-D و TDZ). 66
تصویر ۷–۴ تشکیل کالوس، تشکیل ریشه‌چه در ترکیب تیماری ۱۰ (۵ میلی‌گرم ۲,۴-D و۴ میلی‌گرم TDZ)، ج- تشکیل ساقه‌چه در ترکیب تیماری ۱۷ (۱۰ میلی‌گرم در لیتر ۲,۴-D، ۱ میلی‌گر‌م در لیتر BAP و ۴ میلی‌گرم در لیتر TDZ) 68
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار ۱-۴ تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد مختلف ۲,۴-D، TDZ و BAP بر جنین‌زایی سوماتیکی از ریز نمونه برگ رقم خضراوی ۵۴
نمودار ۲-۴ مقایسه میانگین تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشدی ۲,۴-D،IAA ، IBA و NAA بر جنین‌زایی سوماتیکی بر روی ریز نمونه برگ رقم استعمران. ۵۷
نمودار ۳-۴ مقایسه میانگین اثرات متقابل غلظت‌های مختلف کلشی‌سین و مدت زمان تیمار با کلشی‌سین روی کالوس‌زایی بساک خرما ۶۳
نمودار شماره ۴-۴ مقایسه میانگین تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌ی رشد ۲,۴-D، TDZ و BAP بر روی کالوس‌زایی میوه نارس نخل خرما ۶۵
نمودار ۵-۴ مقایسه میانگین تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌ی رشد ۲,۴-D، TDZ و BAP بر روی کالوس‌زایی آندوسپرم خرما ۶۷
فهرست پیوست‌ها
عنوان صفحه
پیوست ۱ ترکیب محیط کشت پایه MS و محلول‌های ذخیره‌ای آن ۹۴
پیوست ۲ ترکیب محیط کشت پایه Y3 مایع و محلول‌های ذخیره آن ۹۵
فصل اول
مقدمه و اهداف
فصل اول مقدمه و اهداف
۱-۱ مقدمه
نخل خرما^[۱] (Phoenix dactylifera L.) گیاهی دیپلوئید (۲n = 36)، چند ساله^[۲]، تک‌لپه^[۳]، دو‌پایه^[۴]، دگرگشن^[۵] و همیشه سبز^[۶] بلند است که متعلق به خانواده آراکاسه^[۷] می‌باشد (اسلام و همکاران^[۸]، ۲۰۱۱). این خانواده ۲۰۰ جنس و ۲۵۰۰ گونه دارد (فاو^[۹]، ۲۰۰۸). نخل خرما به دلیل سازگاری و تحمل طبیعی بالا با شرایط نامساعد محیطی از قبیل خشکی، شوری و درجه حرارت بالا نقش اقتصادی و اجتماعی مهمی در مناطق بیابانی خاور‌میانه و شمال آفریقا را داراست (باکیت و همکاران^[۱۰]، ۲۰۰۸). به طوری که تقریباً ۹۵ درصد از خرمای تولیدی کل جهان در خاور‌میانه تولید می‌شود (اسلام و همکاران، ۲۰۱۱).
براساس شواهد باستان شناسی قدمت کشت نخل خرما در ایران بیش از هفت هزار سال پیش می‌رسد که از بین‌النهرین منشاء گرفته است (وریگلی^[۱۱]، ۱۹۹۵). تعداد کل درختان نخل در جهان ۱۰۵ میلیون و مساحتی حدود ۸۰۰ هزار هکتار را می‌پوشاند (جین^[۱۲]، ۲۰۰۷). در حال حاضر خرما در پنج قاره دنیا و در بیش از ۳۴ کشور کشت و مورد بهره‌برداری قرار می‌گیرد. بیش از نیمی از خاک کشور ایران مستعد کشت و پرورش خرما می‌باشد. در حال حاضر، ۲۱ درصد خرمای جهان از ایران تأمین می‌شود. در سال ۱۳۸۸، ایران با حدود ۲۵۳ هزار هکتار سطح زیر کشت و با تولیدی بالغ بر ۱۰۵۴۰۰ تن، از بزرگ‌ترین تولید‌کنندگان خرما در دنیا بوده است و از نظر سطح زیر کشت بعد از امارات متحده عربی و از نظر تولید بعد از کشور مصر در رتبه دوم جهانی قرار داشت (فاو، ۲۰۰۹) که از این سطح ۸۴ درصد را درختان بارور و ۱۶ درصد را درختان غیر بارور یا نهال تشکیل می‌دهند.
۲-۱ بیان مسأله
خرما گیاهیست دو‌پایه که پایه‌های نر و ماده آن به صورت مجزا هستند. اما تا زمان گلدهی از همدیگر قابل تفکیک نیستند. نخل خرمای ماده پس از ۵-۳ سال به ثمر می‌نشیند و به طور کامل در ۱۲ سالگی بالغ می‌شوند (جین، ۲۰۰۶). تکثیر خرما از طریق جنسی^[۱۳] و رویشی^[۱۴] است که تکثیر رویشی از طریق پاجوش^[۱۵] و تکثیر جنسی آن از طریق بذر صورت می‌گیرد. در گیاهان تکثیر شده از طریق رویشی بیماری‌های متعددی از قبیل بیماری‌های باکتریایی، قارچی، ویروسی و مایکوپلاسمایی تجمع‌ یافته که باعث کاهش بهره‌وری می‌گردد. معمولاً برای تکثیر خرما پا‌جوش‌های ریشه‌دار شده ترجیح داده می‌شوند زیرا آنها تولید درختان با کیفیت مشابه با درختان مادری خود می‌کنند (الخیری^[۱۶]، ۲۰۰۱). به این که هر درخت تعداد بسیار کمی پا‌جوش در طول زندگی خود تولید می کند (۳-۸ عدد) و برخی از ژنوتیپ‌ها پاجوش تولید نکرده و پا‌جوش‌ها مشکلاتی از قبیل عدم وجود ریشه را خواهند داشت (پوپنو^[۱۷]، ۱۹۷۳)، تولید از طریق پاجوش محدود بوده و مقرون به‌صرفه نمی‌باشد. تکثیر از طریق بذر نیز دارای محدودیت‌هایی از قبیل سرعت کم جوانه‌زنی، تنوع در نتاج تولیدی و نیاز به چندین سال برای رسیدن به مرحله‌ی باردهی و عدم تمایز درختان نر و ماده از هم تقریباً تا ۵ سال بعد از کشت می‌باشد (چند و همکاران^[۱۸]، ۲۰۰۴).

برای غلبه بر مشکلات تکثیری، حل مشکلات مربوط به هیبریداسیون و برای حفظ ژرم پلاسم، ریز‌ازدیادی در شرایط آزمایشگاهی^[۱۹] (جنین‌زایی سوماتیکی یا اندام‌زایی) یک روش موفقیت‌آمیز است که تکثیر سریع جهت تولید تجاری ارقام برگزیده، تکثیر گیاهان با کیفیت بالا و یکسان از لحاظ ژنتیکی، تکثیر در مقیاس وسیع، ذخیره سازی طولانی مدت (انجماد^[۲۰])، بسته‌بندی، صادرات آسان و سریع، دستکاری ژنتیکی، کاهش مدت زمان تولید نهال، تولید خارج از فصل و گیاهچه‌های عاری از آلودگی را فراهم می‌آورد (ایک و همکاران^[۲۱]، ۲۰۰۵). جنین‌های سوماتیکی می‌توانند به طور غیر‌مستقیم از طریق کالوس یا به طور مستقیم و بدون دخالت کالوس تشکیل ‌شوند. گیاهچه‌های حاصل از کالوس گاهی اوقات تفاوت‌های ژنتیکی یا اپی‌ژنتیکی مختلف نسبت به کلون والدینی خود نشان می‌دهند به‌ویژه زمانی که دوره واکشت طولانی گردد در نتیجه کالوس غیر‌یکنواخت حاصل می‌گردد (کنی‌تا و کوثری^[۲۲]، ۲۰۰۲). همچنین برخی از هورمون‌ها در محیط کشت مانند ۲,۴-D ماهیتاً جهش‌زا هستند (حمید و همکاران^[۲۳]، ۲۰۰۹). جهش رخ داده در طی کالوس‌زایی که سبب ایجاد تنوع سوماتیکی در گیاهچه‌ها گردیده به‌ویژه زمانی که تنوع ایجاد شده سبب ایجاد صفاتی مانند تحمل به تنش‌های زنده و غیر زنده، کیفیت بالاتر از کلون‌های مادری و دیگر صفات زراعی باشد، می‌تواند مفید واقع ‌گردد (ال‌حفرمی^[۲۴]، ۲۰۰۹)، همچنین زمانی که تولید زیاد گیاهچه مد نظر است جنین‌زایی غیر‌مستقیم کاربرد دارد. جنین‌زایی سوماتیکی به واسطه‌ی مرحله کالوس‌زایی در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی بسیار کار‌آمد و محبوب است.زیرا گیاهچه‌های کشت بافتی که از طریق کالوس تولید می‌شود پتانسیل جنین‌زایی نابجا را دارا هستند. این جنین‌های سوماتیکی را می‌توان با پوشش مناسب به عنوان بذور مصنوعی به‌‌کار برد (بابخیت، ۲۰۰۵). تکنیک‌های موجود تکثیر سریع خرما به افزایش تقاضا برای میوه خرما در سراسر جهان کمک کرده است (جین، ۲۰۱۱).
۳-۱ ضرورت و اهمیت موضوع
در جنین‌زایی سوماتیکی انتخاب منبع ریز‌نمونه حساس‌ترین تصمیم بوده است، لذا از منابع مختلف گزارش‌های متعددی منتشر شده است. تلاش‌های اولیه از طریق رویان‌های تخم (شروئیدر^[۲۵]، ۱۹۷۰) بوده و بعد‌ها ریزنمونه‌هایی از قبیل رأس ساقه، برگ‌های اولیه‌، جوانه‌ی‌ جانبی، برگ‌های جوان و گل آذین مورد بررسی قرار گرفته است. در بسیاری از آزمایشگاه‌های تجاری، نخل خرما با جنین‌زایی از ریز‌نمونه رأس ساقه تولید می‌گردد که استفاده از این ریزنمونه‌ و استفاده از محیط‌های با اکسین بالا باعث بسیاری از مشکلات تکنیکی از جمله آلودگی‌های درون‌زای باکتریایی، قهوه‌ای شدن، تنوع سوماکلونال و مدت زمان طولانی جهت تولید (حدود ۳ سال) شده است و این در صورتی انجام‌پذیر است که پروتکل شناخته شده‌ای وجود داشته باشد ( ابول ‌سعود^[۲۶] و همکاران، ۲۰۰۴). بنابراین ریزنمونه‌های جایگزین مناسب برای غلبه بر مشکلات ذکر شده در بالا مورد نیاز است. به عنوان مثال در آلودگی‌های باکتریایی میان‌بافتی می‌توان از ریز‌نمونه‌های جوان یا ریز‌نمونه‌های بافت آوندی نابالغ استفاده کرد (افکای^[۲۷]، ۲۰۰۵). همچنین استفاده از گل نر و بلاخص بساک‌ها به دلیل هاپلوئید بودن آنها و آلودگی کمتر مورد توجه قرار گرفته است. با این حال، نرزایی در گونه‌های چوبی^[۲۸] تنها در تعداد معدودی موفقیت‌آمیز بوده است (پیکسا و همکاران^[۲۹]، ۲۰۰۴). تاکنون نر‌زایی در نخل خرما گزارش نگردیده است و تنها مطالعات کمی بر روی کشت بساک نارگیل انجام گرفته است. از دیگر موارد، کشت جنین است که شامل برداشت جنین استریل از بذر و کاشت آن در یک محیط غذایی استریل است. کشت جنین برای نجات جنین‌ و یا رشد جنین از هیبریداسیون بین‌گونه‌ای^[۳۰] (جانستون و استرن^[۳۱]، ۱۹۵۷) و کاهش دوره خواب^[۳۲] طولانی مورد استفاده قرار می‌گیرد (هودد^[۳۳]، ۱۹۷۷). رابشلت و گس^[۳۴]، ۱۹۷۴ ریزنمونه‌هایی از جنین خرما را در شرایط درون ‌شیشه‌ای کشت دادند، میوه سبز نخل خرما، دو تا سه ماه بعد از گرده افشانی برداشت شده و در یک محیط غنی شده با ۲,۴-D کاشته شد، و پس از آن کالوس گره‌دار کرم رنگ به‌دست آمد.
۴-۱ اهداف تحقیق
۱- تعیین تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی^[۳۵] مختلف بر جنین‌زایی سوماتیکی در خرما
۲- بررسی اثر نوع ریزنمونه بر جنین‌زایی سوماتیکی در خرما
۳- بررسی امکان نرزایی در نخل خرما
فصل دوم
مروری بر پیشینه موضوع
فصل دوم مروری بر پیشینه موضوع
۱-۲ منشأ و تاریخچه نخل خرما
نخل خرما با نام علمی (Phoenix dactylifera L.)، احتمالاً یک واژه فنیقی^[۳۶] است. واژه “Phoenix” از یک پرنده‌ی اسطوره‌ای یونان باستان به‌نام سیمرغ گرفته شده که زائیده‌ی آتش است و dactylifera از واژه‌ی یونانی “daktulos” به معنای یک انگشت است که بیانگر شکل میوه ‌خرماست (لینه^[۳۷]، ۱۷۳۴).
نخل خرما در لوح‌های آشوریان و بابلی‌ها به تصویر کشیده است، ازجمله لوح مشهور حمورابی، که شامل قوانین مربوط به کشت و فروش نخل خرماست. منابع مربوط به نخل خرما نیز در نوشته‌های مصر باستان، سوریه، لیبی و فلسطین یافت می‌شود (پوپنو، ۱۹۷۳). از آنجایی که سابقه‌ی طولانی مدت در کشت و توزیع گسترده و صادرات نخل خرما وجود دارد، منشاء دقیق نخل خرما ناشناخته است، اما به احتمال زیاد از منطقه بین‌النهرین و یا غرب هند سرچشمه گرفته است (وریگلی، ۱۹۹۵). مدارک بیشتر از قدمت زیاد درختان خرما در دره نیل مصر خبر می‌دهد که از آن به عنوان نمادی برای سال در هیروگلیف مصری و برگ ساقه آن به عنوان یک نماد برای ماه استفاده شده است (داوسن^[۳۸]، ۱۹۸۲).
۲-۲ گسترش جغرافیایی نخل خرما در جهان
نخل خرما متعلق به خانواده پالمئاسه^[۳۹] است که حدود ۲۰۰ جنس و ۲۵۰۰ گونه را داراست (داوسن، ۱۹۸۲). بر اساس گزارش درانسفیلد و اول^[۴۰] (۱۹۸۶) نخل خرما به شرح زیر طبقه‌بندی شده است: گروه: اسپادیسی‌فلورا^[۴۱]، راسته: پالمئا^[۴۲]، خانواده: پالمئاسه،^[۴۳]، زیر خانواده: کوری‌فوئیده^[۴۴]، قبیله: فونیسه^[۴۵]، جنس: فونیکس، گونه: داکتیلی‌فرا. فونیکس دارای ۱۲ گونه است که اکثراً به عنوان درخت زینتی شناخته شده و دارای ارزش تجاری بسیاری هستند از جمله P. canariensis Chabeaud که معمولاً به نام نخل جزیره قناری نامیده می‌شود. همچنین P. sylvestris Roxb به ‌طور گسترده‌ای در هند به عنوان یک منبع قندی استفاده می‌شود.
نخل خرما از دیگر گونه‌های نخل با داشتن چند ویژگی از جمله تولید پاجوش، دارا بودن تنه‌ی بلند استوانه‌ای و نسبتاً ضخیم، ارتفاع بیش از ۲۰ متر و داشتن برگ‌های سبز مات (به جای برگ‌های سبز براق در گونه‌های دیگر) قابل تشخیص است (بلاتر^[۴۶]، ۱۹۲۶).
به‌ طور کلی نخل خرما در دنیای قدیم (شرق، شمال آفریقا و اسپانیا) و دنیای جدید (استرالیا و قاره آمریکا) به صورت تجاری در مقیاس وسیع کشت می‌گردد (جانسون^[۴۷]، ۲۰۱۰). نخل خرما با توجه به طول و عرض جغرافیایی در نیمکره شمالی بین N°۱۰ و N°۳۹ و در نیمکره‌ی جنوبی بینS °۵ تا S°۳۳ توزیع یافته است (زهری هاف^[۴۸]، ۲۰۰۰) و از نظر ارتفاع از سطح دریا، نخل خرما در ۳۹۳ متر از زیر سطح دریا تا ۱۵۰۰ متر بالاتر از دریا رشد می‌یابد (ال- بکر^[۴۹]، ۱۹۷۲).
نخل خرما دارای ۳۶ کروموزوم (n=18) است (بیل^[۵۰]، ۱۹۳۷)، اما چندین مورد پلی‌پلوئیدی توسط ال‌صالح و ال‌جراح^[۵۱] (۱۹۸۷) در ارقام خرما عراقی (۲n = 64) گزارش شده است. آنها همچنین تفاوت‌های بین ارقام را گزارش دادند: سایر^[۵۲] به عنوان یک رقم زود‌رس (۲n = 32) و خساب^[۵۳] یک رقم دیر‌رس (۲n=36) گزارش گردیده است. علاوه بر این در هر دو رقم آنیو‌پلوئیدی و یوپلوئیدی مشاهده شده است (سایر: ۳۲، ۳۴، ۳۶ و ۶۴؛ خساب ۳۲ و ۳۶).
۳-۲ وضعیت تولید نخل خرما در جهان و ایران