۱-۱۲: کشت بافت
کشت درون شیشه ای پروسه ای است که در طی آن قطعات کوچک بافت زنده گیاه (که اصطلاحا Explant نامیده می شود) تحت شرایط استریل در محیط کشت کاشته می شوند. نمونه های کشت شده تحت شرایط محیطی کنترل شده از نظر نور، درجه حرارت و رطوبت نسبی نگهداری می شوند. در این تکنیک برای اصلاح کننده این امکان را فراهم می سازد تا با حفظ ویا تغییر منابع ژنتیکی وهمچنین افزایش تنوع ژنتیکی ، بتواند ژنوتیب برتر را انتخاب کرده ودر حد بالایی تکثیر نماید (طباطبایی، ۱۳۸۸).
۱-۱۲-۱: انواع کشت بافت
تکنیک های انواع کشت بافت گیاهی را عمدتا به پنج دسته طبقه بندی نمود (افشاری پور، ۱۳۷۲).
۱-کشت کالوس: کشت دانه رست[۱۴]، قطعات جدا کشت،[۱۵] گیاهان بر روی محیط های حاوی آگار که منجر به تولید توده های سلولی آمورف می شود را کشت کالوس می نامند.
۲-کشت سلولی: کشت سلولها در محیط های مایع (بدون آگار) در ظرفهایی که معمولا با تکان دادن تهویه می شوند را کشت سلولی می گویند.
۳-کشت اندام[۱۶]: کشت جنین ها، بساکها، تخمدان ها یا دیگر اندامهای گیاهی برروی محیط های مغذی را کشت بافت می نامند.
۴-کشت مریستم وریخت زایی[۱۷]: کشت مریستم های نو ساقه یا دیگر قطعات جدا کشت بر روی محیط های مغذی به منظور تولید گیاهان کامل را کشت مریستم وریخت زایی می نامند.
۵-کشت پروتوپلاست: جداسازی پروتوپلاست های گیاهان و کشت دادن آن ها بر روی محیط های مناسب را کشت پروتوپلاست گویند (افشاری پور، ۱۳۷۲).
۱-۱۳: محیط کشت و بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت
محیط کشت یکی از اجزای بسیار مهم تکنیک های کشت سلول وبافت گیاهی است، کاربرد موفقیت آمیز روش های کشت بافت بطور زیادی وابسته به محیط کشت با ترکیبات صحیح است، بنابراین محیط کشت با تکنیک کشت ویژه ای که بکار می رود، متفاوت استف به عنوان مثال فرایند های همچون باززایی گیاهان کامل از سلولها یا بافت ها احتیاج به محیط کشت هایی با ترکیبات متفاوت برای آغاز هر کدام از این فرایندها دارد (Dixon et.al, 1994). علاوه بر ترکیب محیط کشت نقش مهم آن فراهم کردن محیط فیزیکی مناسب برای رشد سلولها و بافت ها است، به عنوان مثال، محیط کشت جامد با فراهم نمودن یک زمینه نگهدارنده فیزیکی، نقشی همچون خاک دارد که ریز نمونه های بافت می توانند در تماس با هوا به منظور تبادلات گازی باقی بمانند یا جایی است که گیاهچه های باززایی شده می توانند ریشه بدهند تمام سلولهای گیاهی زنده احتیاج به آب، مواد غذایی(عناصر معدنی آلی و ترکیبات آلی) وتنظیم کننده های رشد گیاهی (هورمونها) برای ادامه یافتن رشد ونمو دارند، ترکیبات محیط کشت بافت گیاه عموما این نیازمندی را برآورده می سازد و فرمولاسیون های متعددی که به طور معمول استفاده می شوند ترکیبات اساسی مشابه ای دارند (Evan et.al, 2003).
برای شروع کشت بافت یک گیاه خاص باید محیط کشتی انتخاب کنیم که همه نیازهای غذایی ضروری آن بافت را تامین کند. املاح معدنی، تنظیم کننده های رشد گیاهی، ویتامین ها، اسید آمینه و آمیدها، ترکیبات آلی پیچیده، منابع کربنی و انرژی، آب، مواد قوام دهنده و نگهدارنده و گاهی زغال برای تهیه محیط کشت مورد نیاز است (افشاری پور،۱۳۷۲).
۱-۱۳-۱: مواد غیر آلی
بافت های گیاهی کشت شده نیاز به ترکیبات شیمیایی غیر آلی ویژه ای دارند، به غیر از کربن، هیدروژن و اکسیژن، عناصر اساسی دیگری که به مقادیر نسبتا زیادی مورد نیاز گیاه می باشد، عبارتند از: ازت، فسفر، پتاسیم، کلسیم، منیزیم و گوگرد به این عناصر ماکرونوترینت[۱۸] می گویند (افشاری پور، ۱۳۷۲). آهن، منگنز، مس، برم، روی و مولیبدن نیز برای رشد گیاهان لازم است اما به مقادیر خیلی کمتر به این عناصر میکرونوترینت می گویند. بر اساس توصیه های انجمن بین المللی فیزیولوژی گیاهی، عناصری که در غلظت هایی بیش از ۵/۰ میلی مول برلیتر برای گیاهان لازم است، ماکرونوترینت و آنهایی که در غلظت های کمتر از ۵/۰ میلی مول بر لیتر هستند، عناصر میکرونوترینت[۱۹] نامیده می شود. این ۱۵ عنصر که برای رشد گیاهان در طبیعت مهم هستند برای کشت های بافت نیز ضروری می باشند و در ترکیب نمکها و یون‌های محیط‌های کشت مختلف بافت‌های گیاهی از نظر کمی و کیفی اختلاف اندکی وجود دارد (Bhojwanis, 1989).
۱-۱۳-۲: مواد آلی
به استثنای گلسین (اسید آمینو استیک) که از ترکیبات تشکیل دهنده محیط های کشت متعددی می باشد. معمولا اسید آمینه دیگر به محیط های کشت اضافه نمی شود. مشاهده شده است که رشد بافت ها در محیط های کشت در اثر اضافه نمودن مخلوطی از اسید آمینه مهار می شود (افشاری پور،۱۳۷۲).
با توجه به نیاز غذایی سلولهای گیاهی به ترکیبات هیدروکربن، وجود یک منبع خارجی کربن در محیط کشت بافت گیاهی لازم می باشد، قند جزء بسیار مهمی در هر نوع محیط کشت است، و چون معمولا شرایط رشد برای فتوسنتز کافی نیست، و یا اصولا به علت تاریکی، فتوسنتز انجام نمی شود، اضافه کردن قند به محیط زیست، ضروری است. معمولا در کشت این ویترو، از ساکارز با غلظت ۱ تا ۵ درصد استفاده می شود، زیرا این قند نیز بوسیله گیاه سنتز شده و به صورت طبیعی در گیاه منتقل می شود. از گلوکز و فروکتوز نیز ممکن است استفاده شود. غلظت قند انتخاب شده بستگی زیادی به نوع و سن مواد در حال رشد، دارد. معمولا با افزایش قند رشد و نمو زیاد می شود، تا وقتی که به یک حد اپتیمم برسد و سپس در غلظت (خیلی) بالا کم می شود (باقری، ۱۳۸۶).

۱-۱۳-۳: ویتامین ها
ویتامین ها نقش کاتالیزوری در واکنش های آنزیمی دارند، وفقط به مقادیر کم مورد نیاز می باشد. برخی معتقدند که تیامین (ویتامین B1 ) ممکن است تنها ویتامین مورد نیاز تقریبا تمام انواع کشت های بافت گیاهی باشد، در حالی که اسید نیکوتینیک (نیاسین) وپیریدوکسین(ویتامین B6) ممکن است رشد ونمو را تحریک کند. ویتامین های دیگری که در کشت ها ی بافت گیاهی مورد استفاده قرار گرفته اند عبارتند از: پاراآمینوبنزوییک اسید (BABA یا ویتامین Bx)، اسید اسکوربیک(ویتامین C)، بیوتین(ویتامین H)، سیانوکوبالامین (ویتامین B12)، اسید فولیک (ویتامین BC)، پانتوتنات کلسیم (ویتامین B5) و ریبوفلاوین (ویتامین B2 ).ضمنا اسید سکوربیک به عنوان یک آنتی اکسیدان جهت جلوگیری از قهوه ای شدن بافت ها می تواند مفید واقع شود (افشاری پور، ۱۳۷۲).
۱-۱۳-۴: تنظیم کننده های رشد گیاهی
نوع ویژه ای از ترکیبات آلی مورد نیاز برای رشد، تمایز ونمو سلول، تحت عنوان تنظیم کننده های رشد گیاهی یا هورمون های گیاهی می باشند که پنج گروه عمده از این ها شامل اکسین ها، سیتوکینین ها، جیبرلین ها، اسید آبسزیک واتیلن می باشند.
۱-۱۳-۴-۱: اکسین ها
اکسین ها که اولین بار در سال ۱۹۳۱ مورد مطالعه قرار گرفتند باعث دراز شدن سلول های جوانه شده و تقسیم سلولی را در رشد لایه زاینده ساقه افزایش می دهند در حالی که رشد ریشه و شکوفه های جانبی را ممانعت می کنند ( افشاری پور،۱۳۷۲و لاهوتی، ۱۳۷۰). متداولترین اکسین ها عبارتند از: ۲، ۴ دی کلروفنوکسی استیک اسید(۲,۴-D) نفتالین استیک اسید (NAA)، ایندول استیک اسید (IAA)، ایندول ۳، بوتریک اسید (IBA). در غلظت کم اکسین، تشکیل ریشه های نابجا، حالت غالب دارد. در حالی که در غلظت زیاد اکسین، تشکیل ریشه صورت نمی گیرد، و تشکیل کالوس اتفاق می افتد (باقری، ۱۳۸۶).
۱-۱۳-۴-۲: سیتوکنین ها
گروهی از تنظیم کننده های رشد گیاهی که تقسیم سلولی وساقه زایی را تشدید می کنند وبرای تحریک رشد ونمو، به کار می رود؛ بنزیل ادنین (BA)، کینیتین و ۲ip متداولترین سیتوکنین ها در محیط کشت بافت گیاهی هستند. این هورمونها، بویژه اگر توام با یک اکسین اضافه شوند باعث تحریک تقسیم سلولی می شوند؛ در غلظتهای بالا باعث تشکیل ساقه نابجا می شوند؛ اما معمولا از تشکیل ریشه ممانعت می شود، آنها از طریق کم کردن چیرگی انتهایی باعث تحریک تشکیل ساقه نابجا و عقب افتادگی پیری می شود (باقری، ۱۳۸۶).
۱-۱۳-۴-۳: جیبرلین ها
معمولا این گروه از ترکیبات، در کشت این ویتروی گیاهان عالی، به کار می روند، GA3 بیشتر از همه مورد استفاده قرار می گیرد، به طور کلی جیبرلین ها در کشت این ویترو، باعث رشد طولی میانگره ها رشد مریستم یا جوانه ها می شوند، جیبرلین ها، معمولا سبب ممانعت از تشکیل ریشه نابجا و همین طور تشکیل ساقه نابجا می شوند (باقری، ۱۳۸۶).
۱-۱۳-۴-۴: اسید آبسزیک
اسید آبسزیک هورمونی گیاهی است که در ریزش میوه و برگ و همچنین خواب گیاه دخیل است، استفاده از آن در کشت جنین مفید است (باقری، ۱۳۸۱).
۱-۱۳-۴-۵: اتیلن
در منابع علمی، گزارشات متفاوتی در مورد نقش اتیلن در اندام زایی وجود دارد. موارد بی اثر بودن اتیلن روی جنین زایی ودر بعضی موارد، اثر مثبت آن، گزارش شده است (باقری، ۱۳۸۶).
۱-۱۳-۵: عوامل فیزیکی
نور باعث تحریک اندام زایی[۲۰] می شود، اما از رشد ریشه جلوگیری می کند. اثر نور بر اندام زایی ممکن است به طور مستقیم یا غیر مستقیم مربوط به تجمع نشاسته در سلولهای خاص باشد و نشاسته باعث افزایش حضور سیتوکنین ها از جمله کینتین می شود. مقدار نور، دوره نور وکیفیت نور می توانند اثرات مختلفی بر کالوس داشته باشند، تغییر در سطوح داخلی اکسین و سیتوکنین در گیاه می تواند به علت تناوب نوری باشد. دما نیز از جمله عوامل موثر بر رشد سلول بافت گیاهی است، برای اغلب کشت ها، دمای بین ۲۰ تا ۲۵ درجه سانتیگراد برای رشد مناسب است، دمای بالاتر از ۲۸ درجه سانتیگراد باعث تبخیر آب موجود در محیط کشت شده و باعث محدودیت رشد بافت می شود (Evans et.a, 1984 ).
۱-۱۳-۶: قطعا ت جدا کشت
از عوامل موثر در باززایی، سن فیزیولوژی قطعه جدا کشت ، وضعیت فیزیولوژیکی، اندازه قطعه جدا کشت، ژنوتیپ، منشا اندام کشت شده می باشد، هر چه قطعه جدا کشت جوانتر باشد امکان موفقیت در کشت بافت بیشتر است، وضعیت فیزیولوژیکی تاثیر بسیار زیادی روی تقسیم سلولی وتکثیر در محیط این ویترو، دارد به طور کلی قسمتهای جدا شده از گیاهان در حال رویش، در مقایسه با قسمتهای جدا شده از گیاهانی که در مرحله زایشی هستند، در محیط این ویترو راحت تر تکثیر پیدا می کنند، گر چه استثناهایی نیز در موارد فوق دیده می شود. کشت این ویتروی جوانه های برداشته شده از گیاهانی که هنوز در حال استراحت وخواب هستند خیلی مشکل تر است از جوانه های جدا شده از گیاهانی که در خواب نیستند .
اندازه ریز نمونه روی پاسخ به کشت بافت موثر است، کشت ریز نمونه کوچکتر سخت تر است و معمولا محیط کشت باید ترکیبات اضافی داشته باشد؛ ریزنمونه های بزرگتر احتمالا از مواد غذایی و تنظیم کننده‌های رشد بیشتری برخوردار بوده و برای کشت مناسبتر هستند (باقری، ۱۳۸۶).
دامنه وسیعی از ظرفیت تولید مثلی در سلسله گیاهان وجود دارد، گیاهان بازدانه دارای ظرفیت تولید مثلی محدود هستند(به جز زمان جوانی)بین گونه نیز تفاوتهای زیادی در تقسیم سلولی وتوان تولید مثلی، وجود دارد.
گونه‌هایی که در شرایط این ویوو براحتی تولید اندامهای مختلف می‌نمایند،تقریبا در کشت این ویترو هم به راحتی تولید اندامهای مختلف می‌کنند، در هر صورت، در بعضی موارد اختلاف زیادی بین توان تولید مثلی در شرایط این ویوو و این ویترو، وجود دارد گیاهان در قسمتهای مختلف دارای تعادل هورمونی متفاوتی هستند و بسته به محل برداشت ریزنمونه، ریزنمونه می‌تواند حاوی مقدار متفاوتی از هورمونهای داخلی باشد. این تفاوتهای هورمونی منجر به پاسخهای متفاوتی در محیط کشت این ویترو می شود (باقری، ۱۳۸۶).
۱-۱۴: چگونگی انتخاب محیط کشت
انتخاب یک محیط کشت بیشتر بستگی به گونه های گیاهی، بافت یا اندام مورد کشت و هدف از انجام آزمایش دارد (Davis, 1994 ). به منظور انتخاب یک محیط کشت مناسب برای کشت مورد نیاز بهتر است که ابتدا با یک محیط کشت پایه مثل MS شروع نمود، سپس بوسیله یکسری تغییرات کیفی و کمی در محیط کشت از طریق یکسری آزمایشات یک محیط کشت مناسب را بدست آورد (Bhojwanis, 1989).
۱-۱۵: تمایز اندام
مطالعات در شرایط درون شیشه ای نشان داده است که خاصیت توتی پوتنسی به چند گونه اندک محدود نمی باشد و اغلب گونه های گیاهی اگر در شرایط مناسب قرار گیرند، تمایز نشان خواهند داد. برای باززایی یک گیاه کامل از یک سلول یا بافت کالوس، تمایز سلولی کفایت نمی کند و تمایز بایستی به شکل گیری جوانه، ساقه یا جنین منجر شود، این امر با اندام زایی یا جنین زایی سوماتیکی تحقق نمی یابد. در اندام زایی یک ساختار تک قطبی که متصل به بافت آوندی اولیه در درون کالوس است تشکیل می شود ولی در جنین زایی یک ساختار دو قطبی بدون هیچ گونه اتصال آوندی با بافت کالوس مادری یا ریز نمونه شکل می گیرد (باقری، ۱۳۸۶).
۱-۱۶: ریز ازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت
ریز ازدیادی[۲۱] عبارت از تکثیر درون شیشه ای گیاه از اندام ها، بافت ها، سلولها و پروتوپلاست وغیره. در برخی منابع نیز عنوان ریز ازدیادی طیف وسیعی از روشها و تکنیک های کشت بافت را شامل می شود که از جوانه، نوک ریشه، رویان ها، پرچم ها، و حتی سلولهای منفرد به عنوان ریز نمونه در آنها استفاده می شود، اکثر گیاهان عالی دارای مریستم هایی در محور برگ هستند که هر کدام قادر به ایجاد گیاه کامل می باشند. مریستم ها محلهایی در گیاه هستند که در آن جا تقسیم سلولی میتوز فعال می باشد و از آن محل ها بافت های دائمی منشا می‌گیرند، گروهی از سلولهای تمایز نیافته در نوک ساقه و شاخساره ها وجود دارند که تشکیل مریستم انتهایی[۲۲] را می دهند. همچنین این سلولها ممکن است بین آوندهای چوبی و آبکش قرار گیرند که مرسوم به کامبیوم[۲۳] می‌باشند و یا در برگهای جوان و در قسمت پایین قطعات بین گره ای واقع می شود که مریستم انترکالری[۲۴] نامیده می شوند. به طور کلی هدف ریز ازدیادی حداکثر تولید از یک گیاه در یک زمان معین ودر عین حال ایجاد مجموعه ای از گیاهان با خصوصیات ژنتیکی یکسان و با صفات کمی و کیفی مورد نظر می باشد (باقری، ۱۳۸۶).
۱-۱۷: ریشه زایی
معمولی ترین پاسخی که در کشت ریز نمونه های مختلف گیاهی در کشت بافت مشاهده می شود ریشه می باشد. به طور کلی ریشه زایی در پاسخ به هورمونهای اکسینی از قبیل IBA، NAA، IAA تشکیل می گیرد از میان هورمون ها NAA و IBA به فراوانی در مورد بسیاری از گیاهان استفاده شده است. برای گیاهانی که به سادگی ریشه می دهند این مرحله ضروری نیست و بسیاری از پروتکل های تجاری این مرحله را حذف می کنند.
فصل دوم:
ادبیات وپیشینه پژوهش
شوان وشیلدن (۱۸۳۸)، آزمایشات کشت بافت گیاهی را با ارائه تئوری توتی پوتنسی آغاز کردند، مفهوم توتی پوتنسی اشاره به این دارد که هر سلول زنده مانند یک واحد مستقل و توانا عملکرده، قادر به ایجاد ارگانیسم جدید می باشد، همچنین باعث تحریک توده بافت گیاهی و یا تک سلولهای جدا شده برای باززایی می شود بنابراین هر سلول گیاهی ممکن است در اثر شکل پذیری فیزیکی و یا تحریک محیطی خصوصیات توتی پوتنسی از خود نشان دهد (طباطبایی، ۱۳۸۸).
طباطبایی (۲۰۰۹) بیان کرد که تکنیک کشت بافت گیاهی این امکان را برای اصلاح کنندگان فراهم می سازد تا با حفظ و یا تغییر منابع ژنتیکی و همچنین افزایش تنوع ژنتیکی، بتواند ژنوتیب برتر را انتخاب کرده و در حد بالایی تکثیر نماید .
طی گزارشات روت و همکاران (۲۰۰۶) ریز ازدیادی گل و گیاه زینتی از طریق کشت درون شیشه ای برای اولین بار در انگلیس و فرانسه در دهه ۱۹۶۰ شروع شد، ارکیده ها، گلهای داوودی و میخک اولین گیاهانی بودند که تکثیرشان با سیستم درون شیشه ای مورد بررسی قرار گرفت. تکنیک کشت بافت گیاهی به نسلهای بعد کشیده شد و در آغاز دهه ۱۹۷۰ کاربرد عملی زیادی یافت، امروزه بسیاری از آزمایشگاه های تجاری در اروپا، آمریکای شمالی و جنوب شرقی آسیا سالانه میلیون ها ارکیده را با قیمت پایین تولید می کنند. پس از مطالعات دانشمندان، تکثیر همسانه ای گلها وگیاهان در مقیاس تجاری آغاز شد، تکثیر همسانه ای درون شیشه ای موجب دستیابی به تولید تجاری گیاهچه گلها و گیاهان زینتی شد.
به گزارش واندر (۱۹۹۲) کشت بافت در بیشتر از ۵۰ نوع گل سوخ دار تشریح شده است، اما تنها لیلیوم به صورت تجارتی تولید می شود.
با آزمایشات نیتچ وهمکاران (۱۹۶۷) سیتوکنین ها معمولا به عنوان افزایش دهنده تشکیل جوانه ها در بسیاری از اندامهای کشت بافتی در محیط درون شیشه ای می باشند.
به گزارش جونگ (۱۹۹۶)، وارشنی (۲۰۰۱) و بهرو کامپتن (۲۰۰۴) یکی از بهترین و فراوان ترین روش ازدیاد لیلیوم در محیط کشت درون شیشه ای، استفاده از قسمت رویشی فلس می باشد.
طی آزمایشاتی عوامل مختلفی روی باززایی جوانه های نابجا در کشت درون شیشه ای فلس لیلیوم، موثر می باشد از جمله غلظت اکسین ، سیتوکنین (Jeong, 1996; Varshney et al, 2001)، غلظت ساکارز (Jeong, 1996; Varshney et al, 2001)، تیمار نوری(Varshney et al, 2001; Kumar et al, 2005) ، موقعیت فلس و نوع ریز نمونه (Jeong, 1996; Varshney et al, 2001) .
در گیاه سنبل اولین تحقیقات کشت بافتی توسط سانیوسکی وهمکاران در سال ۱۹۷۴ انجام گردید درآن آزمایشات بیشترین تاثیر را روی تشکیل پیاز، تعادل بین دو هورمون اکسین و سایتوکنین دانستند، در محیط بدون هورمون یا محیطی با غلظتppm 1یا ۱۰ هیچگونه رشد و اندام زایی را نداشتند. و وجود NAA در غلظت بالا باعث ایجاد کالوس و تولید ریشه و غلظت مساوی بین NAA و BA از تشکیل کالوس و ریشه جلوگیری می کند.
استیگمان و پیریک در سال ۱۹۷۵ورودنیکی درسال ۱۹۷۹ طی آزمایشاتی با کشت درون شیشه ای سنبل به این نتیجه رسیدند که با اضافه کردن IAA تعداد پیازهای تولید شده سنبل افزایش یافته و اضافه نمودن GA3 از تشکیل پیاز جلوگیری می کند.
تاکایاما در طی تحقیقاتی (۱۹۸۰) افزودن مقادیر کم NAA را در محیط کشت سبب بهتر شدن تشکیل پیازچه دانستند.
آرتریک و همکاران ( ۱۹۸۱) طی آزمایشاتی گزارش نمودند، که برای باززایی پیازچه اضافه نمودن NAA به تنهایی مناسب تر از ترکیب آن با سیتوکنین می باشد.
کیم وهمکاران ( ۱۹۸۱) با ازدیاد درون شیشه ای سنبل روی بسترMS محتوی mg/l3 BA و mg/l 3/0 NAA تعداد پیازچه ها را تا ۹۰% افزایش دادند.
تاکایاما و همکاران (۱۹۸۲) تاثیر سیتوکنین و اکسین را در اندام زایی Lilium auratum Lindl. وLilium speciosum Thunb. cv.Uchida در شرایط درون شیشه ای مورد بررسی قرار دادند و گزارش کردند، افزودن هورمونهای گیاهی به محیط کشت، جهت تمایز و رشد اندام ها ضروری است، نتایج مطالعات این محققین، نشان دادند، که شرایط بهینه برای تشکیل سوخک های متعدد در گونه Lilium auratum Lindl. محیط کشت MS حاوی ۱/۰ میلی گرم در لیتر NAA به همراه ۷/۹ میلی گرم در لیتر KIN یا ۱/۳ میلی گرم در لیتر BA و در گونه L. speciosum Thunb. cv.Uchida محیط کشت MS حاوی ۱/۰ میلی گرم در لیتر NAA به همراه ۳ میلی گرم در لیتر Kin یا ۱ میلی گرم در لیتر BA است، همچنین با افزایش غلظت NAA تمایز ریشه تحریک می شود، اما غلظت های بالاتر اثر بازدارنده دارد .
نیمی (۱۹۸۴) گزارش نمود که در Lilium rubellum توانایی تکثیر و تولید پیازچه ها در ریز نمونه های حاصل از ساقه بیشترین میزان را داشتند، به طوری که ۹۸% از ریز نمونه ها سوخک تولید نمودند .
نیمی (۱۹۸۵) گزارش کرد، که NAA به میزان ۰۵/۰ و ۱/۰ میلی گرم بر لیتر، تشکیل پیازچه ها را در Lilium rubellum تحریک می کند، و اضافه کردن BA تاثیر بسیار کمی دارد.
تاکایاما و همکاران (۱۹۹۱) به این نتیجه رسیدند، که در محیط کشت مایع غلظتهای بالای BA، تشکیل پیازچه را در سنبل تحریک می کند.
بچ و همکاران (۱۹۹۲) با کشت ریز نمونه های سنبل در بستر(w/v) 3% ساکارز (mM 6/87) یا فروکتوز mM) 5/166) یا گلوکز (mM 5/166) توانستند پیازهای بیشتری را نسبت به بستر ۶% تولید کنند.
دابروسکی (۱۹۹۲) به نقل از بسیاری از پژوهشگران آورده اند که اثر تنظیم کننده های رشد در اندام زایی لیلیوم های کشت شده متفاوت بوده، سیتوکنین ها روی باززایی پیازچه وشاخه های حاصل از مریستم تاثیر تحریک کنندگی اندک داشته، و موثرترین غلظت NAA را برای تشکیل پیازچه لیلیوم mgl-1 ۱/۰گزارش کرد. همچنین گزارش کردند، که تشکیل پیازچه از ریز نمونه های اولیه لیلیوم رقم Sonnentiger در محیط کشت حاوی نفتالین استیک اسید (mgl-1 ۱/۰) و غلظت پایین سیتوکنین(mgl-1 ۳/۰ ،۱/۰) در بالاترین میزان خود بود، و بالاترین تعداد پیازچه در محیط کشت حاوی نفتالین استیک اسید، ۲ip و بنزیل آدنین باغلظت ۱/۰ میلی گرم در لیتر بدست می آید.